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设想与实现
设想
PCR从设想到研究已经有超过100年的历史了,在二十世纪60年代末、70年代初,人们对基因的体外分离技术投入了很多的精力,在1971年,核酸体外扩增的设想首先由Korana提出。
实现
1985年具有划时代意义的聚合酶链反应由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明。它的原理和DNA的体内复制类似。
步骤
标准的PCR过程包括三个步骤:
DNA变性
(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA。
退火
(60℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
延伸
(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性Z佳)的作用下,合成与模板互补的DNA链。每经过变性、退火和延伸一循环,DNA含量就会增加一倍。
PCR反应的物质
镁离子、三磷酸脱氧核苷酸、耐热DNA聚合酶、引物以及模版均是参加PCR反应的物质,其中引物的Z佳设计是其关键步骤。
1. Mg2+浓度
镁离子可以和dNTP结合,镁离子能够很大程度上影响PCR扩增的特异性和产量。在通常的PCR反应中,当各种dNTP浓度为20μmol/L时,镁离子的浓度Z好为1.5~2.0mmol/L。如果镁离子浓度过高,那么就会降低反应特异性,使得非特异扩增出现。如果浓度过低,会使得taqDNA聚合酶的活性降低,减少反应产物。
2. dNTP
三磷酸脱氧核苷酸的质量与浓度和PCR扩增效率密切相关。在PCR反应中,三磷酸脱氧核苷酸应为50-200μmol/L,特别需要留心的是4种三磷酸脱氧核苷酸要有一样(等摩尔配制)的浓度,如果浓度过低,则会使得PCR产物的产量降低
3. TaqDNA聚合酶
2496个碱基为TaqDNA聚合酶基因的全长,当温度达到75~80℃时,每秒钟大约有150个核苷酸由一个酶分子延伸。在PCR循环的高温条件下DNA聚合酶活性和稳定性依然表现的良好。如今,可以提供两种TaqDNA聚合酶,diyi种是大肠菌合成的基因工程酶,第二种则是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶。
4. 引物
引物与模板DNA互补的程度决定了PCR产物的特异性。在理论上,只要对任意一段模板DNA序列有所了解,就可以根据其将互补的寡核苷酸链作引物设计出来。每条引物链的浓度为0.1~1μmol或10-100pmol,Z好是反应所需要的Zdi引物量的浓度。
5. 模板核酸
PCR成败与否的关键环节之一。就是模板(靶基因或样品DNA)核酸的量与纯化程度。临床检测标本通常使用快速简便的方法对细胞进行溶解,对病原体进行裂解,将染色体的蛋白质消化去除从而使靶基因游离,对于PCR扩增可以直接 使用。通常采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法对DNA模板提取,值得注意的是要防止RNA被核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)降解了。
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