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对特定的DNA片段起到放大扩增作用的一种分子生物学技术,被称为聚合酶链式反应。其可以被当作生物体外的特殊DNA复制,能够大幅增加微量的DNA。1971年Khorana首先提出设想,1985年Mullis发明了聚合酶链反应。
PCR原理
生物进化和传代的重要途径为DNA的半保留复制,在多种酶的作用下双链DNA变性能够解旋成单链,在DNA聚合酶的作用下,按照碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。通过实验表明,在高温时,DNA也能够发生变性解链,当温度降低时,又能够复性成为双链。所以,DNA的变性和复性能够通过变化温度来控制。加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就能够使得特定基因的体外复制完成。
然而,当高温时,DNA聚合酶容易失活,所以,每次循环都必须将新的DNA聚合酶加入。不但操作变得复杂,而且成本变高,使得PCR技术的应用和发展受到了制约。
对于PCR的应用来说,Taq酶的发现具有里程碑的意义,在90℃以上的高温下,此酶依然不失活,不再需要每次循环加入新的酶。不但使得CR技术操作变得简单,而且使得成本大大地降低,从而使PCR技术被广泛的应用,并且在临床方面逐步得到应用。
PCR技术的基本原理和DNA的天然复制过程类似,与靶序列两端互补的寡核苷酸引物是其特异性的关键。变性-退火-延伸是构成PCR的三个基本反应步骤。
①模板DNA的变性:
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,成为单链,为它与引物结合提供便利,为下轮反应作准备。
②模板DNA与引物的退火(复性):
模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
③引物的延伸:
DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,根据碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性-退火-延伸三个步骤就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又能够变成下次循环的模板。
06-19
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