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对特定的DNA片段起到放大扩增作用的一种分子生物学技术,被称为聚合酶链式反应。其可以被当作生物体外的特殊DNA复制,能够大幅增加微量的DNA。1971年Khorana首先提出设想,1985年Mullis发明了聚合酶链反应。
PCR反应的五要素:
酶、引物(PCR引物为DNA片段,细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)分别为参加PCR反应的五种主要物质。
引物
引物有多种设计方法,PCR在实验中的目的决定了引物的设计,然而基本原则是一样的。
酶
PCR主要有两种来源的酶可供使用,分别是Taq和Pfu,他们来源于两种不同的噬热菌。它们互有优缺点,Pfu有纠错功能却扩增效率弱,Taq扩增效率强却但易发生错配。因此,在实验时,对于酶的选择必须必须按照实际需要来决定。
模板
模板就是扩增用的DNA,可以是任何来源,然而其有两个原则:一是其必须有很高的纯度,再就是纯度又不能过高防止起到YZ作用。
缓冲液
缓冲液具有非常复杂的成分,缓冲液主要包括水、缓冲体系、一价阳离子、二价阳离子以及辅助成分。通常使用HEPES或MOPS缓冲体系。钾离子是Z为常用的一价阳离子,然而在在特殊情况下也能使用铵根离子。二价阳离子就是镁离子,按照反应体系确定,没有特殊情况发生无需调整。DMSO、甘油等为常见的辅助成分。它们主要起到保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构的作用。
06-19
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