NanoLC-蛋白质组学研究质谱分析的**前端分离工具

内容节点: 概述; 实验/设备条件; 样品提取; 实验/操作方法; 实验结果/结论; 仪器/耗材清单

美国戴安公司的LC-PACKING纳升级HPLC是当今世界Zxian
进的微量色谱之一.已经广泛应用于蛋白质组学的研究
领域.特别是其同MADLI TOF质谱的完全兼容性,使得LC-
PACKING更是广大MADLI TOF质谱用户的**选择.

LC Packings/Dionex /Nano LC 系统的组成:
1.UltiMate™微孔泵和检测单元流速范围从 50 nl/mi
n 到 200 µl/min,压力范围0-6000psi
2.FAMOS™ 微量自动进样器，样品体积：50nL-5 µl，
5 µl-1mL，注入样品量为 1 µl 输出样品量也是1µl
(无样品丢失)，取样对象可以是96384多孔板，1.5ml
样品瓶（密封与开口均可，（双针技术）放置7块384孔
板，可连续取样2688次内置双泵可以完成梯度2D色谱
分析.
3.Swithchos™ 微孔柱切换单元，允许全柱切换和快速
加载样品典型的装置
4.Probot 微量样品收集器,是目前**一种可以直接将
分离样品点在MALDI TOF 质谱专用板上的样品收集仪
器.可以同ABI公司,布鲁克公司等大型TOF质谱直接连
接.
工作流程
用 FAMOS™向反向捕获柱注入样品, 使用Switchos™加
载泵以 30 µl/min的速度加载样品.
样品进到捕获柱后， Switchos 阀切换关闭， UltiMat
e™ 单元的Nano梯度以 200 nl/min的速度将捕获柱中
的浓缩样品反冲到NanoLC的分析柱中，分析柱直径是7
5 µm ，填料是C18 PepMap™.，各种组分在这里分离然
后进入质谱检测NanoLC的技术特点
1.提供了比毛细管液相更高的灵敏度2.使用 Capillar
y/Nano 柱，可在日常工作中达到Z高的分离效率和极
好的峰容量
3.由于分析柱极小的直径，成为分析极少的样品量和稀
释样品的极好分析技术4.确保Z少的样品丢失与质谱联
机有zhuo越的性能（特别是具有电喷雾离子源（ESI）的
在线质谱，可以Z小的流速提供高浓度的样品）
Capillary/Nano LC 与 MS联机:
1.可达到Z高的灵敏度，使得毛细管/毫微级液相**
的分离效果与质谱Z高的分辨检测结果有机地结合；
2所有的进样分离检测和数据处理全部自动化：
全自动样品处理和导入多维分离MS/MS测序和采
集数据库搜索；3翻译后的修饰的鉴别；4可大大
增加蛋白鉴别的通量5可与ESIMALDI离子源质谱
联机
Peak parking 峰停驻技术
峰停驻技术用来增强 MS/MS 的灵敏度,用来分析不太复
杂的蛋白混合物(<50)；峰停驻技术可配合使用原位消
化技术，使灵敏度增加（样品量减少，光谱信息增
加）；可改进数据质量和序列的覆盖面原位消化技术
与2D胶相比可增加蛋白识别数量；可识别高含量蛋白污
染下存在的低丰量蛋白，同时极大地节省实验时间
峰停驻技术可做下列描述：
•进入质谱的峰淋洗速度被降低，使得有更多的时间识
别先进入的离子.
•同时从 Nano LC分析柱来的淋洗液被停止.
UltiMate™ 系统提供Nano梯度淋洗(200 nl/min),
在 Nano LC (75 µm i.d.)柱中进行分离，被分离的组
分通过微量阀进入质谱，一旦进入质谱的峰达到一个确
定的峰高，MS将切换成MS/MS方式并得到MS/MS的光
谱，同时给出两个信号：1微量阀被通知关闭，喷
射泵与MS在线连接，喷射泵以 25 nl/min的速度工作，
给质谱留有更多的时间得到MS/MS光谱,. 2UltiMate
™ 系统被通知保持梯度 (35%B remains 35%B) ，流
速进一步降低以保持柱压的稳定，一旦质谱中的峰从一
个确定的溢出或确定的高度开始下降，MS开始切换回质
谱的模式，微量阀和UltiMate™接到通知恢复到峰停驻
发生开始时的条件

NanoLC 2维液相色谱技术
2维毛细管/NanoLC/MS可取代2D凝胶分析2D凝胶被广
泛地应用在蛋白质组学的研究中，但它有下列的缺点：
1重现形不好
2覆盖的蛋白数量少
3对低峰量蛋白的灵敏度不够
4消耗时间和劳动力
5pH范围有限
6不能直接与质谱在线联机

以下是典型的UltiMate Nano LC系统2D分离的流程：
样品用FAMOS微量自动进样器注入到BioX-SCX离子交换
捕获柱上.通过自动进样器上的梯度泵缓慢梯度改变淋
洗盐溶液浓度(at 30 ul/min),从 BioX-SCX柱上将肽的
不同片段分别洗脱,并通过RP捕获柱分别收集，当捕集
到肽后，盐被冲洗出系统并确认盐不会进入MS,此时Nan
oLC的主梯度泵(200 nl/min) 开始从捕获柱反冲肽
片段进入NanoLC毛细管分析柱，肽在这里被分离,Z后
进入MS做定性