单细胞凝胶电泳原理及流程

单细胞凝胶电泳技术，又叫做彗星试验，其首次由Ostling和Johanson提出，之后又经过Singh等进一步的完善。其是一种在单个细胞水平上对DNA损伤、交联和修复进行检测的方法。由于其具有快速、低耗、灵敏以及简单等优点而在流行病学调查、遗传毒理、生物检测等诸多方面得到广泛的应用。

原理：

大多数DNA链是磷酸复合物，在生理条件下，DNA的多局核酸大多呈阴离子状态，当DNA链由于如紫外照射等外在原因断裂时，负螺旋的结构就会变得松散，如此，在电场的作用下，DNA即会通过一定的速度移动到正极。

细胞裂解液会破坏掉细胞膜、核膜等结构，胞内蛋白质、RNA以及其他成分都会在溶液中扩散，然而由于核DNA具有很大的分子量，因此只能够留在原位。

通过碱的处理以及在碱性电解质的作用下，DNA解旋，会释放出损伤的DNA断链和它的片段。在电泳条件下，DNA片段能够进入凝胶孔隙发生迁移，因为这些DNA具有很小的分子量，因此，会在电泳过程中，从核DNA离开，移动到正极，使彗星状的图像形成。

在一定的条件下，DNA含量分布以及DNA迁移距离和DNA损伤程度为线性相关的关系。断片的数量伴随着DNA损伤程度的加剧而增加，DNA含量的增加，彗尾的延长以及荧光强度的加强为其的具体表现。

流程：

1.制取细胞

对处于对数生长期的Hela细胞进行获取，将其进行吹打使其成为单细胞悬液，使用PBS将细胞的密度调节为每毫升10⁵-10⁶个。

2.细胞染毒

染毒组：获取1毫升细胞悬液，将10^-3 MH₂O₂溶液50微升，混合均匀，在37摄氏度条件下水浴半个小时。

阴性对照组：获取1毫升细胞悬液，将50微升PBS缓冲液加入，在37摄氏度条件下水浴半个小时。

3.制片

第1层胶：将180微升1％质量分数的正常熔点琼脂糖铺在完全磨毛的载玻片上，在室温环境下固化十分钟。

使用吹风机稍微加热玻片，从而使琼脂糖凝固延缓。

第2层胶：对30微升细胞悬液以及50微升0.8％质量分数的低熔点琼脂糖进行获取，将它们混合均匀之后在第1层胶上滴加，加盖片然其均匀铺开，在4摄氏度条件下凝固10分钟。

第3层胶：将盖片移开，在第2层胶上滴加100微升0.5％质量分数的琼脂糖，加盖片，在4摄氏度条件下凝固10分钟。

4.凝胶裂解

在冷的裂解液中放入制好的凝胶，在4摄氏度条件下裂解120min。

5.DNA解旋

在裂解液中取出载玻片，使用蒸馏水将过多的盐洗去，晾干。

在电泳槽中倒入新配制的电泳缓冲液，大概将载玻片0.25厘米覆盖，将盖子盖上，为了使DNA解旋，需要将其放置在ph值很高的电泳缓冲液中20分钟。

6.电泳

在室温的条件下，对缓冲液液面进行调节，在电流200毫安，电压20伏特条件下电泳20分钟。

7.中和

在0.4M Tris缓冲液中浸入凝胶，浸洗半个小时。

8.染色观察

使用20每升20微克的吖啶橙染色3-5分钟，表面的染料使用双蒸水洗掉，在24h以内使用荧光显微镜进行观察