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  善缘小杰我爱你 2009-11-25 00:00:00

  为什么不问师兄或者导师呢

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  longwub 2009-11-25 00:00:00

  其实很简单的啊。你不用一个一个的加酶切接头，因为很麻烦而且效率低。我看你是想在你的序列两端加上RcoRI和HindIII位点是吧？你直接将你的基因（应该就是你的PCR产物吧，用高保真酶扩增出的平头片段）加A后连接到来源于pUC18或19载体的T载体上即可，因为T载体插入位点两端就有EcoRI和HindIII位点。插入T载体的好处是，即使载体上没有你满意的酶切位点，你也可以用质粒为模板用加酶切位点的引物去扩增。 ———————————————————————————————— 你既然已经连接到T载体上了，那就可以再设计一对加了HindII和EcoRI酶切位点的引物，用T载体为模板去扩增啊。这样子的扩增效率是很高的。

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  我前天订的 2009-11-25 00:00:00

  补充回答： 看了楼主的问题补充，据此给一个补充回答：建议以现有TA克隆的质粒为模板，用两端分别带有EoRI和HindIII酶切位点的目的基因特异性引物再次PCR扩增目的基因，此次扩增产物为两边带有酶切位点的目的基因，将其再次TA克隆后，分别EoRI和HindIII双酶切载体和新的TA克隆，做目的构建。不用担心TA载体上自有的EoRI和HindIII切点，因为离目的基因Z近的“一刀”是引物上的切点，产生的目的基因片断不会带有TA载体上的序列的。试试看吧，听起来似乎麻烦，做起来很容易的。 你要实在嫌麻烦，可以以你现有的TA克隆为模板，在目的基因两端特定位点分别做点突变而产生EoRI和HindIII切点，点突变直接买试剂盒，合好引物按照说明书来做就行了，做完了别忘测序确证一下。 下面我原来给这两个建议在平时构建实验中也是很有用的： _______________________________________________________ 我有两个方法建议给你： 1、同意楼上的建议先做TA克隆，但是不建议用TA克隆上的切点。因为如果如楼主所说“这段基因是纯粹的目的基因”的话，就涉及到后续做表达载体时要考虑读码框的问题。我的建议，先做TA克隆，再以TA克隆的质粒为模板，用带有合适酶切位点的引物去做PCR扩增，扩增产物再次TA克隆后，酶切构建。（注：不建议直接酶切PCR产物，很难切且难以判断是否成功酶切）。 2、另外一个不用引入酶切位点的建议：按构建设计去酶切目的构建的基本载体，用klenow大片段补平载体的粘性末端，然后用连接酶直接与平末端目的基因做连接，再在阳性克隆中筛选目的基因插入方向正确的目的克隆。这个方法构建比较容易做，后续目的克隆筛选可以选一个载体上的引物和一个目的基因上的引物配对PCR，以此判定阳性克隆中目的片段的插入方向。

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