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      Z近数十年以来肿瘤的免疫ZL相关研究取得了革命性的突破，特别是基于PD-1、CTLA-4等类似的免疫检查点YZ剂的ZL方案表现尤为突出。但是即便如此，肿瘤的免疫ZL领域仍然面临巨大的挑战，比如治LX果的不确定性、患者反应的不可预估性、免疫ZL耐药抵抗及检测生物标志物缺乏等都制约了对肿瘤患者的jing准有效ZL。

Balkwill F R, Capasso M, Hagemann T. The tumor microenvironment at a glance.

      当前大量的临床案例和科学研究表明肿瘤免疫微环境的深度解析将是破除肿瘤免疫ZL障碍的关键所在。肿瘤免疫微环境在肿瘤发生、侵袭、转移及ZL耐受过程中占据重要位置，细化免疫微环境的细胞免疫分型，切实有效的分子分型定量研究是指导肿瘤jing准ZL的基础，也是在jing准医学时代背景下亟需解决的难题。

      独特的PhenopticsTM多光谱组织微环境景观分析方案融合了Opal多色荧光样品标记、Vectra多光谱成像和inForm智能组织定量分析技术，可以wan美的实现传统分析方案难以解决的技术难题，从而更好的实现对于肿瘤患者的jing准诊断和ZL。

      2019年6月26日，Nature杂志在线发表了巴黎大学Jérôme Galon教授研究组题为Immune evasion before tumor invasion in early lung squamous carcinogenesis的研究论文，该文充分利用了PhenopticsTM组织微环境分析方案对于肺癌病人样本的肿瘤免疫细胞进行了深度的分型分析，阐述了肺鳞状细胞癌发生过程在侵袭前病变组织和肿瘤微环境的细胞分型改变以及相关免疫细胞空间分布定位的差异性变化，从而揭示肿瘤免疫微环境的重塑有利于对肿瘤的发SF展进行调控和jing准ZL，为提高肿瘤免疫ZL的有效率提供了新的技术思路和方法。

Nature. 2019 Jun 26. doi: 10.1038/s41586-019-1330-0

      该研究工作的ling导者Jérôme Galon教授一直致力于利用PhenopticsTM组织微环境分析方案进行肿瘤免疫ZL研究和新的免疫ZL组合策略方案开发。附图来自Jérôme Galon教授基于Opal多色荧光标记技术获取的肿瘤组织免疫微环境描绘图片，为肿瘤免疫诊断和jing准ZL提供重要的参考依据。

来源：https://www.epo.org/learning-events/european-inventor/finalists/2019/galon.html

      全新的PhenopticsTM组织微环境分析方案可以实现在组织切片样本上实现多达9色的靶点抗原荧光标记和检测，并且进行多种类型细胞的分型定量研究深度挖掘组织微环境所蕴含的生物学信息，从而为肿瘤的免疫学研究和jing准ZL提供可靠依据。

Phenoptics™  组织微环境分析方案—Opal 9色荧光标记示例图

关于珀金埃尔默：

珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决Z棘手的科学和YL难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。

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最近一段时间，随着疾病诊疗的精 准化，各个版本新冠诊疗指南的出炉，淋巴细胞亚群、精细亚群和细胞因子等与免疫力监控高度相关的指标受到了高度关注。

在众多的免疫指标中，选择哪些监测指标，如何建立自建方案并验证，如何建立与疾病诊疗相关指标的Cutoff值，这些都是当下流式工作者们开展更多免疫指标时会遇到的一些难题。下面这篇文章对上面提到的几个问题做了详细的解答。

01.背景介绍

免疫检查点抑 制剂治 疗，特别是联合PD-1/CTLA-4 阻断，显著提高了转移性黑色素瘤患者的治 疗率和总生存率 。但同时，与免疫相关的不良反应，如肝炎和结肠炎，是免疫抑 制剂治 疗过程中常见的并发症，其严重的时候可以危及到生命 。在接受PD-1和CTLA-4的一些晚期黑色素瘤患者中，巨细胞病毒 (CMV)引起的特异性记忆 T 细胞反应会导致肝损伤，而有研究表明治 疗前血液中 CD4+ 效应记忆 T 细胞 (TEM) 的扩增能够可靠地预测肝炎；所以如果有一种方案可以监测效应记忆T细胞，从而预测不良反应的发生，其将具有很好的临床意义。

本文章作者开发并验证了一个10色流式细胞方案，用于可靠地量化外周血样本中的 CD4+ TEM细胞和其他 irAE 风险的生物标志物。与以前的方案相比，文章作者的新方案在测量CD4+ TEM细胞方面表现出色，并且在从CD4+ CD197+ CD45RA+ 幼稚T细胞（Naïve T）分辨CD4+ CD197+ CD45RA- 中 央记忆T细胞 (TCM) 方面表现出色。它还能够精确量化 CD14+单核细胞。

02.实验方案

CD4+ TEM细胞的标记为CD45+ CD3+ CD4+ CD8- CD45RA- CD197- 。单核细胞的相同标记为 CD45+CD14+，同时加上将 CD16，以对经典、中间和非经典单核细胞进行更精细的分类。有研究表明将 CD8+ T 细胞中的 CD279 (PD-1) 表达确定为黑色素瘤患者接受 PD-1/CTLA-4 治 疗后临床反应的标志物 ，因此加上 CD45+ CD3+ CD4- CD8+ CD279+ 。为了提高细胞类型定义的准确性，方案中还包括了一个谱系排除 (Lin) 通道（CD19、CD20、CD56 和 CD66b）来排除B 细胞、NK 细胞和粒细胞。因此，新panel包括 10 个参数：CD45、Lin、CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD197 (CCR7)、CD279 (PD-1)、CD14 和 CD16，作者将该方案命名为“monocyte and T cell”，简称“MoT”。

该方案用Beckman Coulter的液体试剂进行验证，并在验证完成后，作者将该方案定制成干粉形式，由于干粉产品相比较液体试剂，不仅可室温保存，并且保存时间更久，同时还可以减少实验操作，样本间一致性也更高等优点，便于日常诊断工作并最 大限度地减少差异。

贝克曼库尔特公司不仅可以提供Duraclone干粉成品试剂，还可以提供客户定制CDS，可以根据客户需求，个性化组合定制干粉方案。相比较液体方案来说，定制化的干粉组合方案，不仅有液体单抗方案的自由组合的优点，而且还有干粉试剂的优点。

03.方案圈门策略

该方案用贝克曼库尔特公司的Navios 3激光10色仪器进行数据的采集，并使用Kaluza软件进行分析。

3.1  对CD45+ 白细胞进行圈门；

3.2  对CD3+ T 细胞和CD3- 细胞进行圈门；

3.3  对CD3-内的谱系阴性 (Lin-) 细胞进行圈门；对CD14+ 单核细胞进行圈门；对由 CD14 和 CD16 表达定义的单核细胞亚群进行圈门；

3.4  对CD3+ T 细胞内的CD4+ 和 CD8+ T细胞进行圈门；对CD4+ 记忆T细胞亚群进行圈门；圈门CD279+ CD8+ T细胞。

04.检测性能验证

文章作者将此方案与贝克曼库尔特公司的DURAClone IM T 细胞亚群管 和 DURAClone IM Basic管平行分析了来自 83 名患有II、III 或 IV期疾病的黑色素瘤患者的样本，其中II 期(n = 52)、III期(n = 11) 或IV期(n = 20)。除CD14+ 单核细胞外，其他参数均观察到方法之间的强相关性，CD14+ 单核细胞显示出中等相关性。

DURAClone IM Basic和DURAClone IM T是贝克曼库尔特公司的Duraclone IM全套抗体组合方案中的第1管与第3管。该产品的优点是干粉，保存的时间比液体更久；而且预混抗体也能节省实验时间，相比于自己混匀抗体后分装染色，样本间的一致性会更高。产品质量满足ISO 9001认证标准（ISO 9001-2008）。

文章作者之前确立了一个cutoff值≥16% CD4+ TEM 细胞作为 CMV Ig+ 患者检查点阻断相关肝炎的预测因子。因此在将患者分类为 CD4+ TEM ≥16% 或 CD4+ TEM <16% 时，DURAClone IM T 细胞亚群管和 MoT测试管结果在 81/83 例 (98%) 中一致。此外，E图显示在确定 CMV 血清学状态，并在治 疗开始后 12 周内评估免疫相关肝炎的发展。红色虚线表示 CD4+ TEM ≥ 16% 的cutoff值， 中值用黑线表示，MoT 方案在预测 16 名 IV 期黑色素瘤患者的肝炎方面表现良好。F图显示6 名 CMV IgG+ CD4+ TEM ≥16% 黑色素瘤患者中有 5 名正确预测了肝炎。

经过验证，文章作者用cutoff值≥16% CD4+ TEM 细胞作为 CMV Ig+ 患者检查点阻断相关肝炎的预测因子，相关的PPV=83%，NPV=80%。

另外，文章作者还从批内精密度、批间精密度、操作者间分析精度、样本稳定性、样本染色稳定性、年龄、性别和疾病相关偏倚、季节性等方面进行了验证，确保该方案结果是在可接受范围内的，由于篇幅的关系，就不一一列出来了，感兴趣的读者可以去原文查看，其详细的介绍了作者验证思路与结果。