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       在4种维生素E异构体测试过程中，该如何进行键合相的选择？是否遇到过β-生育酚和γ-生育酚分离不理想、峰形差、柱压高等问题？面临这些问题，我们该如何排查和解决？

一、键合相的选择

      首先我们看一下4种维生素E的结构（如图1.1），对于反相分离模式，我们通常从极性差异来判断能否分离，从非极性看，α-生育酚>β-生育酚≈γ-生育酚>δ-生育酚，用常规C18色谱柱，意料之中，β-生育酚和γ-生育酚由于非极性差异太小，不能实现分离（如图1.2）。

图1.1  维生素E结构式

图1.2  C18分离4种维生素E异构体谱图

      同样属于反相分离模式，为什么C30色谱柱可以实现2种物质的分离呢（谱图见后续二、三、四部分）？

       首先我们看下C30色谱柱，和C18色谱柱相比，烷基链更长，由于填料的孔径都是约为120Å，孔表面键合的烷基链越长，不同位置键合的烷基链交叉重叠的可能性增大，待测组分通过孔内的阻力增大，C30分离β-生育酚和γ-生育酚依靠的是空间位阻作用。

二、“峰形差”怎么办？

2.1 流速的影响

色谱条件：

色谱柱：Athena C30 4.6 × 250 mm, 3 μm(PN: LAEQ-462553)

柱温：20℃

流速：0.8ml/min

进样量：10μl

紫外检测波长：维生素E为294nm

流动相：A：甲醇     B：水

测试结果：

      按照GB5009.82-2016第1法中色谱条件，我们发现β-生育酚拖尾，为了排查β-生育酚拖尾原因，首先尝试将流速调为0.9ml/min，β-生育酚不拖尾，在27.8min附近多一个鼓包，干扰α-生育酚的定量，不进样走流动相，也有该鼓包，说明是流动相梯度混合产生的基线波动，流速为0.8ml/min时，基线鼓包和β-生育酚出峰接近，造成β-生育酚拖尾。继续增大流速至1.0ml/min，目标物出峰时间提前，α-生育酚和基线鼓包可以分开。

      按照GB5009.82-2016DY法中色谱条件，采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 3 μm(PN: LAEQ-462553)，通过增大流速，可以避免基线波动对目标峰的干扰，另外β/γ-生育酚的分离度也得到改善。具体结果见表2.1。

表2.1 不同流速条件的结果分析

2.2 流动相的影响

      既然上述条件，β-生育酚“拖尾”是由于梯度程序造成，考虑到整个梯度程序流动相的组成差异很小，我们直接采用甲醇为流动相，也可以避免基线鼓包造成的峰形差等干扰。

总结：

      该案例中的“峰形差”是梯度流动相梯度混合产生的基线波动造成的假象，通过增大流速或者将流动相调为甲醇即可解决。

三、β-生育酚和γ-生育酚分离不理想怎么办？

3.1 流速的影响

      参考表2.1，增大流速后可以避免基线波动对目标峰的干扰，另外β/γ-生育酚的分离度也得到改善。流速是怎么影响β-生育酚和γ-生育酚分离度的呢？还是要从分离度的计算公式来看，

      增大流速后，由于色谱柱和流动相种类没有变化，选择性α保持不变，由于整个梯度程序，流动相的组成变化不大，所以k变化较小，而β-生育酚和γ-生育酚的柱效提高，所以分离度得到改善。

3.2 柱温的影响

      采用甲醇为流动相时，参考2.2中结果，β/γ-生育酚的分离度只有1.55，勉强达到基线分离，我们尝试将柱温降低为15℃，β-生育酚和γ-生育酚的分离度明显得到改善，达到1.90。

      柱温是怎么影响分离度的呢？柱温的影响相对比较复杂，它对柱效、选择性和保留因子都有影响，从而对分离度产生影响，这里就不详细分析柱温对每个参数的影响程度了。这个案例说明β/γ-生育酚的分离对柱温比较敏感，遇到分离度的问题时可以考虑降低柱温。

总结：

      β-生育酚和γ-生育酚分离不理想，梯度条件，可以通过增大流速解决，甲醇做流动相等度条件下，可以通过降低柱温解决。

四、有没有更好的选择？

      我们发现，用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm(PN: LAEQ-462552)，粒径从3 μm增大为5 μm，在满足分离度的前提下，系统压力更低哦，见表3.1。

表3.1 不同色谱条件下的对比

总结：

       采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm (PN: LAEQ-462552)，甲醇做流动相，可以实现更优的结果，α-生育酚出峰时间早、β/γ-生育酚分离度好、柱压更低。

五、总结

      5.1 遇到“峰形差”问题，首先排查是否流动相的影响，可以通过空走流动相来确认，该案例中的“峰形差”是梯度流动相梯度混合产生的基线波动造成的假象，通过增大流速或者将流动相调为甲醇即可解决。

5.2 β-生育酚和γ-生育酚分离不理想，梯度条件，可以通过增大流速解决，甲醇做流动相等度条件下，可以通过降低柱温解决。

      5.3 采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm (PN: LAEQ-462552)，甲醇做流动相，可以实现更优的结果，α-生育酚出峰时间早、β/γ-生育酚分离度好、柱压更低。