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Western免疫印迹(Western Blot)的原理是什么?

尹翔尹宇 2013-11-19 19:23:05 575  浏览
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  • jy827981568 2013-11-20 00:00:00
    Western免疫印迹 (Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表 达产物,可通过融合部分的抗体检测。 原理 与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝 酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗 体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋 白水平的表达。 ……………… 详细资料请参考:on http://product.bio1000.com/101887/

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Western免疫印迹(Western Blot)的原理是什么?
 
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Western Blot技术篇---样品制备

Western Blot 是一种用于检测蛋白质以及蛋白质翻译后修饰的常用方法,可以对简单或复杂生物样品中的目标蛋白质进行半定量或定量分析。其操作步骤包括:

•从细胞、组织或体液中制备样品(蛋白质提取和蛋白质浓度测量)

十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶通过电泳按大小分离蛋白质

将分离的蛋白质固定在硝酸纤维素(NC)膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上

封闭膜上的非特异性蛋白

用特异性一抗探测靶蛋白

与标记的化学发光或荧光分子偶联的二抗共孵育

检测反映抗原/抗体结合的信号

使用软件对目标蛋白条带进行光密度分析

Western Blot是分子生物学和蛋白质组学中Z常用的技术之一。但Western Blot是一个多步骤的操作流程,因此任何一个步骤发生错误,都会导致的结果发生变异,从而降低了该技术的可靠性和可重复性。有研究表明,Western Blot的一些关键步骤,例如样品制备方法、跑胶、转膜、抗体的选择以及定量所用的归一化方法,对于可再现的蛋白质印迹结果至关重要。


--样品制备--


Western blot步骤中的一个经常被忽视的方面是有效的样品制备。有效的蛋白质提取和纯化步骤对蛋白质印迹实验的结果和解释有重要影响。为了有效地提取蛋白质,应该选择一种合适的均质化方法,该方法可以通过细胞膜的破裂有效地释放细胞内的内容物。另外,应该选择Z佳的裂解缓冲液以促进蛋白质的正确溶解并防止蛋白水解降解,从而获得大量的目标蛋白质。


样品制备的原则


尽可能采取简单方法,避免蛋白丢失;

尽可能将所有待分析的蛋白质样品全部溶解;

细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解,低温和蛋白酶YZ剂防止蛋白降解;

提取过程中避免蛋白产生聚集、沉淀和变性;

防止发生人为的蛋白质样品化学修饰(例如加入尿素不要超过37℃,防止氨甲酰化而修饰蛋白);

尽可能去除样品中的非蛋白杂质和干扰蛋白;

样品裂解液新鲜配置,并分装冻存于-80℃。勿反复冻融;

制备方法应具有标准化、重现性、可靠性和简便性。


蛋白样品的类型


可溶性蛋白:

培养细胞中可溶性蛋白,包括:细胞质中的可溶性蛋白、细胞周质蛋白、细胞器相关蛋白、分泌到培养基中的可溶性蛋白。

自然宿主细胞中可溶性蛋白,包括:微生物、植物和动物细胞中的可溶性蛋白。

不溶性蛋白:

含包涵体的不溶性蛋白

膜相关蛋白和难溶性蛋白(非重组蛋白)


蛋白样品制备的流程


组织、细胞或菌体的破碎和裂解

沉淀溶液中蛋白

清除杂质

蛋白浓缩、纯化


组织或细胞破碎和裂解


为了全面分析细胞内的蛋白,需要对组织或者细胞进行有效地破碎和裂解,其方法取决于蛋白样品的来源。同时,因细胞破碎时蛋白酶可能释放出来,从而导致蛋白降解,影响后续实验结果,因此需要加入蛋白酶YZ剂进行保护。


破碎裂解的方法


温和破碎裂解法(针对组分单一或者分析某一特定组分):

渗透裂解(血细胞、组织培养细胞):将细胞悬浮于渗透溶液中,细胞因肿胀而释放细胞内容物。

冻融裂解(细菌细胞、组织培养细胞):反复冻融裂解细胞,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度ZG引起肿胀,使细胞结构破碎。

裂解液裂解(组织、培养细胞):含有去污剂的裂解液处理组织或细胞,使细胞膜破碎,细胞内容物释放出来。

酶裂解(植物、细菌、真菌细胞):利用酶裂解含有细胞壁的细胞。

剧烈破碎裂解法(难于破碎细胞:固体组织、坚硬细胞壁):

超声裂解(悬浮细胞):利用超声波产生的切应力来裂解细胞,超声时应在冰上间歇进行。

弗氏细胞压碎器裂解(含有细胞壁的细胞):细胞悬液置于高压下QL挤出小孔,压力突然降低以及剪切力的作用导致细胞爆裂破碎。

机械匀浆裂解(固体组织、细胞悬液):将组织剪成小块,利用匀浆器在加蛋白酶YZ剂的匀浆液中破碎组织或者细胞。

研磨法(固定组织、微生物):样品冻存在液氮中,利用研钵和研杵快速将样品研磨成粉状。

玻璃珠匀浆裂解(含有细胞壁的细胞):利用剧烈震荡的玻璃珠打碎细胞的细胞壁,从而释放细胞的内容物。


裂解液一般组成


缓冲液(Tris-HCl):提供pH环境,使蛋白保持稳定,增加溶解性。

去污剂(表面活性剂):破坏蛋白之间的疏水相互作用,以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。

蛋白酶YZ剂:YZ蛋白酶的活性,防止蛋白被水解。

磷酸酶YZ剂:YZ磷酸酶的活化,防止蛋白样本脱磷酸化。

还原剂:二硫键断裂和蛋白质变性

其它:NaCl,促进细胞膜破裂使蛋白溶解。

常见裂解液成份一览表


蛋白酶YZ剂的类型


常用的蛋白酶YZ剂:

丝氨酸蛋白酶YZ剂:PMSF,AEBSF-HCl,Aprotinin(抑肽酶), Chymostatin,亮肽素(Leupeptin)。

天冬氨酸蛋白酶YZ剂:PMSF,碘乙酸、抑肽素(Pepstatin),云芝发酵物。

巯基蛋白酶YZ剂:PMSF,TLCK,TPCK,Antipain-HCl,N-乙基顺丁烯二酰亚胺。

金属蛋白酶YZ剂(金属离子螯合剂):EDTA,EGTA,塔罗肽。

(磷酸酶YZ剂:NaF、激活的原矾酸钠、焦磷酸钠、β-甘油磷酸钠。)

常见的蛋白酶YZ剂一览表


YZ剂

工作

浓度

分子量

YZ蛋白酶种类

稳定性

AEBSF

1mM

MW:239.5

不可逆的丝氨酸蛋白酶YZ剂,YZ胰蛋白酶,糜蛋白酶,纤溶酶,凝血酶及激肽释放酶。

可溶于水,其pH7 的水溶液在4oC 可保持稳定 1-2 个月,在pH>8 的情况下会发生缓慢水解  

Aprotinins

抑肽酶

2μg/ ml

MW:6512

可逆的丝氨酸蛋白酶YZ剂,可YZ纤溶酶,激肽释放酶,胰蛋白酶,糜蛋白酶,但不YZ凝血酶和Factor  Xa。

非常稳定,当  pH>12.8 时失去活性,可溶于水(10mg/ml),-20oC 下可长期保存。

EDTA,  4Na

10mM

MW:380.2

金属蛋白酶的可逆性螯合物,可能同时影响其他金属依赖性生物过程。

其水溶液很稳定,其贮存液(pH8.5 的 0.5M水溶液)在 4oC 可保存数月

Leupeptin, 半硫酸盐

亮抑酶肽(亮肽素)

100μM

MW:493.6

可逆的丝氨酸及半胱氨酸蛋白酶制剂,可YZ胰蛋白酶样蛋白酶及一些半胱氨酸蛋白酶如:Lys-C 内切蛋白酶,激肽释放酶,木瓜蛋白酶,凝血酶,Cathepsin B 及胰蛋白酶。

工作液的稳定期为数小时,贮存液(10mM 水溶液)在  4oC 时稳定期为一周,-20oC  时稳定期为一个月

Pepstatin  A

1μM

MW:685.9

可逆的天冬氨酸蛋白酶,可YZ胃蛋白酶, Cathepain B&L,血管紧张肽原酶(renin)。

以 1mg/ml  溶于甲醇,搅拌过夜可以1mg/ml 溶于乙醇,333mg/ml 溶于 6N 的

PMSF

1mM

MW:174.2

不可逆的丝氨酸蛋白酶YZ剂,可YZ羧肽酶 Y, 糜蛋白酶,Factor  Xa,木瓜蛋白酶,纤溶酶,蛋白酶K,枯草杆菌蛋白酶,凝血酶及胰蛋白酶。

有毒!请现配现用,并在样本处理过程中分批加入(勿一次性加入),在 pH7.5 时半衰期为一个小时,贮存液(200mM 的甲醇或乙醇溶液)在 4oC 可保存 9 个月以上

抑肽素 A



很多细菌来源的天冬氨酸蛋白酶,与蛋白酶有微弱的结合。

乙酸,4oC  下可保存一周。

Trypsin Inhibitor,

Soybean

与需YZ的蛋白酶等摩尔浓度

MW:20000

可逆的丝氨酸蛋白酶YZ剂,YZ Factor Xa 及胰蛋白酶。

在低 pH 值情况下分解,其贮存液在-20oC时相当稳定。

Amastatin

10μM

MW:474.6

可逆的丙氨酰-氨基肽酶YZ剂。  

其水溶液只可保存一天,其 1mM 的乙醇溶液在-20oC 可保存一个月

Antipain,  2HCl

100μM

MW:677.6

可逆的丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶YZ剂,可YZ木瓜蛋白酶及胰蛋白酶.对纤溶酶也有一定YZ作用.与Leupeptin  相比,它对木瓜蛋白酶和胰蛋白酶有更强的特异性。

工作液稳定期仅为数小时,但其10mM 的水(或缓冲液)溶液贮存液在  4oC 可保存一周,在-20oC 可保存一个月,还可溶于甲醇或DMSO。

Chymostatin

100μM

MW:604.9

可逆的 半胱氨酸丝氨酸蛋白酶YZ剂,可YZ糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶,包括lalpha-,beta-,gamma-及 delta-糜蛋白酶


TLCK

100μM

MW:369.3

不可逆的丝氨酸蛋白酶YZ剂,YZ胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶,包括菠萝蛋白酶,Arg-C 内切蛋白酶, 无花果蛋白酶,木瓜蛋白酶,纤溶酶,凝血酶及胰蛋白酶。

pH>7.5 时非常不稳定,贮存液(10mM  的1mM HCl,pH3.0 的水或甲醇溶液)也应该现配现用。 

TPCK

10μM

MW:351.5

不可逆的丝氨酸蛋白酶YZ剂,YZ胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶,包括菠萝蛋白酶,糜蛋白酶,无花果蛋白酶及木瓜蛋白酶。

工作液稳定期为几个小时,贮存液(10mM 甲醇溶液)在  4oC 下可保持稳定几个月。 



参考文献:

Protein Purification and analysis: next generation Western blotting techniques, Expert Rev Proteomics. 2017 Nov;14(11):1037-1053.

An Overview of Technical Considerations for Western Blotting Applications to Physiological Research, Scand J Med Sci Sports . 2017 Jan;27(1):4-25.




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免疫印迹与elisa和western blot有什么区别,似乎原理差别不大,谁能细致说说
 
2017-09-15 21:09:22 769 1
Western Blot归一化讲座精彩内容提炼

期刊对Western Blot数据要求:

1. 内参和目的蛋白在同一张印迹膜上;

2. zuihao选择膜染色进行总蛋白归一化;

3. 如果使用看家蛋白,需要提供看家蛋白表达稳定并且不受实验条件影响的证据;

4. 成像方法的线性范围需要提供。

看家蛋白一般常用于内参质控,整张膜上的weiyi质控标准,但是看家蛋白一般表达量比较高,可能与目的蛋白不在一个线性范围内,影响定量;并且看家蛋白证明在多种实验条件下是会发生变化,例如:细胞融合,疾病和药物ZL等等,影响定量jingzhun性。

总蛋白质控直接在膜上检测总蛋白,变异性小,误差小,动态范围更宽,使用整个泳道或泳道中大部分信号用于归一化,而不是单一的条带,例如JBC、Nature和Proteomics等期刊推荐使用总蛋白进行归一化。

Azure可提供一站式Western Blot归一化解决方案。

提供两种总蛋白染色试剂Azure Red和TotalStainQ进行膜染色和总蛋白归一化,AzureRed适合低丰度表达样品,TotalStain更适合细胞裂解液样品。

Azure Sapphire双模式多光谱激光成像系统和Azure Imager多功能分子成像系统可进行总蛋白归一化,成像更简单,归一化更方便。

Azure成像系统除了可进行Western Blot成像外,功能非常强大,可进行凝胶、In cell Western孔板成像、2D和2D-DIGE、微阵列芯片、切片、动植物组织、小鼠成像、放射性同位素磷屏成像等。

2020-08-18 14:21:44 391 0
ProteinSimple发布单细胞western blot系统

细胞异质性是肿瘤研究,干细胞研究,免疫学研究的极其重要的研究方向。单细胞研究是


分析细胞异质性的主要手段。单细胞组学研究也是jing准医学首要的研究领域。

美国ProteinSimple公司首推基于芯片Western Blot技术,进行单个细胞蛋白质表达水平定


量分析系统: Milo.

Milo具有极其强大的功能:

1. 单张芯片进行1000个单细胞western blot

2. 每个单细胞可进行数十个靶蛋白检测

3. 仅需使用Western blot验证抗体,具有抗体通用性

4. 基于western blot技术,蛋白进行分离后检测,提高免疫学检测特异性

5. 全程检测只需4小时

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蛋白质印迹为什么叫western blot
和方位有什么关系吗?还是历史原因?
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Western Blot归一化:看家蛋白or总蛋白

做Western Blot的小伙伴,是不是还在为归一化方法而纠结呢?今天小编就和大家汇总一下看家蛋白和总蛋白归一化的方法。

看家蛋白归一化

使用看家蛋白的缺点是在样品间和不同条件下表达水平可能不一致。如使用看家蛋白进行标准化,必须先花费时间和精力来验证内参的选择。

使用看家蛋白的第二个重大挑战是它们的表达丰度很高,如果样品中的看家蛋白表达非常高,这会限制在凝胶上加载的样品量,如果感兴趣的蛋白不是同样的表达丰度,那这两种蛋白质就不在同一线性检测范围内。

如果您正在进行多重蛋白印迹,例如比较同一蛋白质的磷酸化和非磷酸化形式,则需要考虑的第三个挑战是从不同物种中产生一抗和二抗的复杂性。

检测的看家蛋白可能干扰感兴趣蛋白的检测。理想情况下,看家蛋白应该与感兴趣蛋白的大小不同,因此这两种蛋白可在印迹上空间分辨。当实验在同一印迹上检查多种目的蛋白时,这就变得越来越困难。


总蛋白归一化


使用总蛋白归一化,是直接在膜上检测总蛋白,并且该值在归一化时用作分母。总蛋白染色提供更宽的动态范围,并且表现出比看家蛋白更低的可变性和更准确的定量数据。

与使用看家蛋白相比,图像采集后的分析工作流程基本不变; 整个泳道或泳道中大部分信号用于归一化,而不是单一的条带。

例如:JBC、Narute和Proteomics等期刊会推荐使用总蛋白归一化方法。

使用总蛋白染色剂对膜进行染色提供了质控优势,可以验证转印是否完全。


Azure提供全套的总蛋白归一化解决方案。咨询请拨打:电话:010-57256059



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