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- cuichaoqun92 2017-04-24 00:00:00
- 有哪位高手用过novagen的his-Binding蛋白纯化试剂盒 1. 前处理 把蛋白质从原来的组织或溶解状态释放出来,保持原来的天然状态,并不丢 失生物活性。常用的方法:匀浆器破碎、超生波破碎、纤维素酶处理以及溶菌酶等。 超声波破碎法:当声波达到一定频率时,使液体产生空穴效应使细胞破碎的技术。超声波引起的快速振动使液体局部产生低气压,这个低气压使液体转化为气体 ,即形成很多小气泡。由于局部压力的转换,压力重新升高,气泡崩溃。崩溃的气泡产生一个振动波并传送到液体中,形成剪切力使细胞破碎。 2. 粗分级 分离可用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大, 3. 细分级 样品的进一步纯化。样品经粗分离以后,一般体积较小,杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化,一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳、等电聚焦等作为Z后的纯化步骤。 结晶是Z后的一步 分离纯化的方法:1.分子大小;2.溶解度;3.电荷;4.吸附性质;5.对配体分子的生物亲和力等。 (一)根据分子大小不同的纯化方法 1. 透析 利用蛋白质分子不能通过半透膜,使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。 2. 密度梯度离心。 蛋白质颗粒的沉降系数不仅决定于它的大小,而且也取决于它的密度。 3. 凝胶过滤 利用蛋白质分子大小,因为凝胶过滤所用的介质是凝胶珠,其内部是多孔的网状结构。当不同的分子大小的蛋白质分子流过凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子进入珠内的网状结构,而被排阻在凝胶珠之外随溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并Z先流出柱外,比网孔小的分子能不同程度底自由出入凝胶珠的内外,由于不同大小的分子所经路径不同而得到分离。大分子先被洗脱下来。小分子后被洗脱 (二)利用溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀和PH的控制 蛋白质处于等电点时,其净电荷为零,由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而聚集沉淀。因此在其他条件相同时,它的溶解度达到Z底点,利用等电点分离蛋白质是一种常用的方法。 2. 蛋白质的盐溶和盐析 中性盐可以增加蛋白质的溶解度,这种现象称为盐溶。盐溶作用是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后,带电层使蛋白质分子彼此排斥,而蛋白质分子与水相互作用加强了,因而溶解度增加 当溶液的离子强度增加到一定数值时,蛋白质的溶解度开始下降。当离子强度足够高时,很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来,这种现象称为盐析。
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