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       今年的春节，我们要从一只蝙蝠，哦不，是从一种病毒说起～

（一）要理解冠状病毒，首先要说说病毒

       病毒是一种个体微小，结构简单，只含一种核酸（DNA或RNA），必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物。

       我们常听说的病毒有鼻病毒（主要引起人的感冒）、HIV病毒（艾滋病的元凶）、埃博拉病毒（致死率超高）、狂犬病毒（致死率近乎的牛X病毒）……到现在为止，谁都不知道在地球上到底有多少种病毒，可能有几百万种，可能有几亿种，反正就是在任何地方、任何生物体中都存在数量不一的病毒，但其中只有约5000种已经被详细描述。

（二）病毒的分类

       病毒那么多，想要正确认识和研究病毒就需要根据不同的依据对病毒进行分类。

       从遗传物质分类：DNA病毒、RNA病毒、蛋白质病毒（如：朊病毒，疯牛病就属于软病毒感染的病）

       从病毒结构分类：真病毒（Euvirus，简称病毒）和亚病毒（Subvirus，包括类病毒、拟病毒、朊病毒）

       从寄主类型分类：噬菌体（细菌病毒）、植物病毒（如烟草花叶病毒）、动物病毒（如禽流感病毒、天花病毒、HⅣ等）

       从性质来分：温和病毒（例如HⅣ）、烈性病毒（例如狂犬病毒）。

       病毒的形态：

       ⑴球状病毒（脊髓灰质炎病毒）

       ⑵杆状病毒（烟草花叶病毒）

       ⑶砖形病毒（天花病毒）

       ⑷冠状病毒（SARS病毒）

       ⑸丝状病毒（埃博拉病毒）

       ……

       OK，知道了病毒的分类，我们可以将这次发现的新型冠状病毒理解为主要感染动物的冠状RNA病毒（注：非生物学严谨描述，仅为简单理解）

（三）冠状病毒

       1937年，冠状病毒（Coronaviruses）首先从鸡身上分离出来。

       1965年，分离出diyi株人的冠状病毒。由于在电子显微镜下可观察到其外膜上有明显的棒状粒子突起，使其形态看上去像中世纪欧洲帝王的皇冠，因此命名为“冠状病毒”。

       到目前为止，大约有15种不同冠状病毒株被发现，能够感染多种哺乳动物和鸟类，到本次新型冠状病毒爆发前，已知的仅有6种可以感染人。其中4种在人群中较为普遍，仅引起普通感冒和一些轻微的呼吸道疾病。另外2种是我们熟知的SARS冠状病毒（引起非典）和MERS冠状病毒（引起中东呼吸综合征）。

       虽然都叫做冠状病毒，但2019年新发现的新型冠状病毒与SARS和MERS还是有很大的不同。从感染的速度和人群来看，受各种因素影响，新型冠状病毒的传染性比较强，但致死率较低，只要做好防护，可以有效避免感染，大家不用过度担心。

（四）传播方式

       1.直接传播：指患者咳嗽、喷嚏、说话的飞沫、呼出的气体近距离直接吸入导致的感染

       2. 接触传播：指飞沫沉积在物品表面接触污染手后，再接触口腔、鼻腔、眼睛等粘膜导致的感染

       3.气溶胶传播（有待论证）：指飞沫混合在空气中，形成气沫核（气溶胶）吸入后导致的感染

（五）新冠病毒入侵机理

       这里我们分享一篇通俗易懂的文章分享给大家，即使没有相关的生物学知识也可以快速了解。《武汉不明原因肺炎初步判定……》

（六）如何识别病毒

       结合世界卫生组织于2020年1月12日发布的针对疑似新型冠状病毒感染造成严重急性呼吸道感染的临床处置指南（通过RT-PCR进行nCoV检测）。1月25日，上海市科学技术委员会公布ZG首 款法定检验机构检定合格的新型冠状病毒检测产品；在获得国家药监局批文后，被发往各地医院、疾控ZX和出入境检验检疫局，用于测定疑似患者的样本中是否有新型冠状病毒，可望加快识别疑似病例。

       此次研发出来的试剂盒的科学原理名为“荧光PCR（聚合酶链式反应）法”，是一种用于放大扩增特定遗传片段的分子生物学技术，能利用聚合酶链式反应将微量的基因片段大幅扩增，从而检测出带有特定基因片段的病毒。

       荧光PCR（聚合酶链式反应）法是目前灵敏度和准确度Z高的检测手段，也是现用的新型冠状病毒的确诊手段它通过聚合酶链式反应，即PCR，检测病人样品的核酸提取物中是否含有该病毒所独有的基因。这种检测方法的前提是必须知晓病毒完整基因序列。在这一点上，我们十分幸运，因为此次“新型冠状病毒感染性肺炎”的罪魁祸首新型冠状病毒的基因序列已被科学家们破译，找到了它所独有的基因片段，因此核酸检测成为可能。

       划ZD！

       要对病毒进行核酸检测，首先必须从各种YL样本中提纯出核酸样本。

       截止2020年2月5日，湖北省全省累计检测样本89600多份，这接近90000的样本有咽拭子，血液等，不同的样本必须经过处理才能得到病毒核酸。如此大的样本量，在YL资源极度匮乏的当下，自动化的仪器设备成了解决此次疫情检测难题的急先锋。

       新芝生物NP-2032全自动核酸提取仪可解放检测人员双手，是病毒核酸提取的必备神器！

NP-2032全自动核酸提取仪

性能特点 

快速GX

纯化后的核酸纯度可满足各类下游实验需求

核酸回收率>95%，磁珠回收率>95%

合计约20-40min可完成32个样本提取（依试剂而定）

安全可靠

全自动操作搭配一次性耗材，减少人员接触

内置可定时紫外消毒，GX清洁

排气风扇，有效避免气溶胶污染

运行中防开门报警并自动停止运动结构，保障操作安全

通用性强

多速度多模块供选择，且可储存100个程序，满足不同客户要求

自定义裂解、洗脱温度

适合于不同样本，如动植物组织、血清、血浆等

操控灵活

大屏幕全彩显示，触控式操作，简单易用

可自定义快捷程序，一键启动

人性化的观察窗、显示屏设计，方便操作

详情请见官网：

https://www.scientz.com/products/p1022.html

详情请咨询热线：0574-88350052

紫外线灯能杀死新型冠状病毒吗？

根据新发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗快速指南》，75%酒精、yi醚、氯仿、甲醛、含氯消毒剂、过氧乙酸和紫外线均可灭活病毒。因此，医用紫外灯对杀灭病毒是有效的。

国家电光源质量监督检验ZX（北京）的微信公众号“国家电光源ZXNLTC”于2020年2月4日发布的《紫外线杀菌灯在防护2019新型冠状病毒传播中的应用》中记载：“以ZX波长253.7nm为代表的紫外辐射对细菌和病毒具有广谱杀灭作用，其有效性在SARS病毒上得到了试验验证，理论上，基于紫外辐射的核酸破坏作用，一定剂量的紫外辐射可杀灭2019新型冠状病毒，在无人条件下使用紫外杀菌灯，其杀菌消毒作用可通过破坏传播途径的方式达到传染防护目的。”

如何快速、准确筛查并确诊新冠肺炎患者成为当前全民战“疫”的重中之重。目前被广泛采用的核酸检测方法检测结果阳性比率低，仅为30％-50％。此外，还有检测流程繁琐、检测时间过长、存在安全风险等缺点。找到快速、准确、安全的新冠病毒检测方案迫在眉睫。2020年2月18日~19日特别举办“新型冠状病毒检测”ZT网络研讨会，为广大一线工作人员开展新冠病毒检测技术交流和推介解决方案。

报告题目: Naica数字PCR检测新冠病毒的解决方案

2019年12月以来新型冠状病毒肆虐，使用常规的荧光定量PCR技术进行的核酸检测，因假阴性问题可能会导致携带病毒而不受防控，将会带来严重的潜在风险。

深蓝云生物开发了基于Naica三色自动化数字PCR系统新冠病毒核酸超敏检测试剂盒方案，数字PCR技术通过将PCR反应体系分成万级以上的反应体系，实现核酸的单分子扩增，通过泊松分布获得核酸的拷贝数，是真正的定量检测方法，具备高灵敏度、高jing准度、高分辨力、高耐受力等技术特征。较qPCR检测提供了更好的检测限和灵敏度，降低了YZ剂的影响，对qPCR核酸检测提供有效的灵敏度补充，拥有三荧光通道的设计为新冠病毒核酸提供了数字PCR多重检测能力，Naica微滴芯片式数字PCR系统正在ZG疾病预防控制ZX病毒所等多家单位进行新冠病毒的超敏核酸检测的方法验证。

检测后利用Keypro生物污染快速净化仪5min对移液器和耗材等表面进行污染消除，防止实验用品导致实验结果污染和环境污染。

时间：2月19日9：30-10：00

主讲人介绍：

李冰，北京深蓝云生物科技有限公司数字PCR产品经理，毕业于中科院生物物理所，从事分子诊断产品的应用开发及市场推广近十年，致力于数字PCR技术在分子诊断领域的应用解决方案开发及实施。

日程：

参会报名：点击“新型冠状病毒检测ZT网络研讨会”官方页面进行报名。为保网络畅通，仅向全国开放200个免费席位。详细报名指南请见官方报名指南。

报名：请登录“北京深蓝云生物科技”网站-新闻动态-“新型冠状病毒检测”ZT网络研讨会，进行报名。

       针对“新型冠状病毒 2019nCoV”，博日公司diyi时间推出了基于不同样本来源、样本量的核酸提取及荧光定量 PCR检测的方案，详细介绍如下：

       一、样本前处理

       二、核酸提取
       核酸提取是分子检测的基础，高质量核酸也是保证下游检测结果的前提，博日的核酸提取深得广大疾控、临床和科研院校客户的信赖和喜爱，无论是病毒类还是病原体类的试剂盒均能保证高质量的核酸提取。

      场景一：适用于大于等于 16个样本的新型冠状病毒等病毒核酸的提取

       配套试剂和仪器：

       特点：

       GX快速：博日仪器能实现 35min内快速实现 3296个样本的高通量自动化核酸提取；

       灵敏度高：DNA病毒可以达到 10I U/ mL，RNA病毒可以达到 50I U/ mL；

       操作简单：使用预分装试剂盒仅需加入样本与 pK即可上机操作，且提取无需核酸助沉剂，保证了多次实验的重复性；

       应用广泛：本试剂盒均采用前沿技术，适用样本类型广泛，可轻松提取如痰液、唾液、肺泡灌洗液、 （鼻咽）拭子、培养细胞及其他体液样本 （如全血、血浆、血清、腹水、脑脊液、口腔液等）等中的病毒核酸，可用于下游如 NGS，qPCR等的检测；

       稳定可靠：博日全自动核酸提取纯化仪配备更全面的深孔加热模块，大幅度降低预设温度与管内实际温差，较小孔间温度差，从而极大地提高了裂解和洗脱的效率，试剂配套仪器，使检测结果更加稳定可靠。

       场景二：适用于大于等于 16个样本的新型冠状等病毒、支原体类、衣原体类及细菌类等引起呼吸道疾病的病原体的核酸提取。

       配套试剂＆仪器：

       特点：

       GX快速：博日仪器配套试剂能实现 40min内快速实现 3296个样本的高通量自动化核酸提取；

      灵敏度高：DNA病毒可以达到 10I U/ mL，RNA病毒可以达到 50I U/ mL；

      操作简单：独特的裂解成分能将样本中的病毒、支原体、衣原体或革兰阴性、阳性细菌的核酸轻松释放，配合预分装试剂盒，得到高质量的核酸；

       应用广泛：本试剂盒均采用前沿技术，适用样本类型广泛，可轻松提取如痰液、唾液、肺泡灌洗液、（鼻咽）拭子、培养细胞及其他体液样本（如全血、血浆、血清、腹水、脑脊液、口腔液等）等的病原体核酸，适用于下游 NGS，qPCR检测；

       稳定可靠：博日全自动核酸提取纯化仪配备更全面的深孔加热模块，大幅度降低预设温度与管内实际温差，且 NPA96核酸具有水平震荡模式，可同时进行前处理，试剂配套仪器，使检测结果更加稳定可靠。

       简单快速：整个提取过程在 30mi n内完成；

       应用范围广：本试剂盒均采用前沿技术，适用样本类型广泛，可轻松提取痰液、唾液、肺泡灌洗液、 （鼻咽）拭子、培养细胞及其他体液样本（如全血、血浆、血清、腹水、脑脊液、口腔液等），适用于下游 NGS，qPCR检测；

       高灵敏：DNA病毒可以达到 10I U/ mL，RNA病毒可以达到 100I U/ mL；

       安全性高：产品中无有毒试剂；

       稳定性好：常温保存；

       纯度高：纯化后的病毒核酸不含 PCR/ RTPCRYZ剂等污染物

       三、Real Ti me荧光定量 PCR检测

       实时荧光定量 PCR方法是目前公认的病原微生物分子检测和鉴定技术，博日在微生物定量 PCR分析方面，提供Z精确，Z灵敏的检测方案。

       针对场景: 适用于 2019nCoV新冠状病毒等核酸的荧光定量检测

       可靠性：选取新型冠状病毒（2019nCoV）WuhanHu1株 Or f 1ab以及 N基因区，设计同时覆盖该基因两个位点的两组特异性引物及荧光探针，而对其它冠状病毒无交叉反应。采用GX的一步法荧光 RTPCR反应系统确保检测结果的灵敏度和准确性。

       特异性：适用于新型冠状病毒核酸检测，与甲型 H1N1，冠状病毒 OC43，冠状病毒 HKU1等核酸，甲型 H1N1流感病毒、甲 3型流感病毒、乙型流感病毒、冠状病毒 OC43、冠状病毒 HKU1、冠状病毒 229E、冠状病毒 NL63等临床阳性样本、中东呼吸综合征冠状病毒等样本均无交叉反应。

       防污染：一步法完成 RTPCR，无须逆转录及 PCR处理，完全闭管扩增和检测，同时避免假阳性结果。

       操作简单，耗时短：只需 1. 5个小时即可完成结果判读。

（来源：杭州博日科技有限公司）

       2019年底，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)肆虐，它的出现及其在世界范围内的广泛传播引发科技工作者对ZL新型冠状病毒肺炎(COVID-19)药物的广泛关注。鉴于COVID-19的高传播性，并且目前尚没有疫苗对其进行有效预防，研发ZL该肺炎的药物就变得尤为重要。Z近，瑞德西韦、磷酸氯喹和法匹拉韦等多种药物已被证明在抗击COVID-19方面具有潜在活性。

       迪马科技一直致力于为药物研发和检测提供强有力的技术支持，针对抗COVID-19药物检测，迪马科技技术人员开发了一种快速LC-MS/MS方法。应用该方法可以同时快速测定6种潜在ZL药物。本方法选用Endeavorsil^® 1.8 μm C18色谱柱，在4.5分钟内即可完成6种药物的同时检测。方法具有简单、快速等优点。可以预期，该方法的应用必将使得这些潜在药物的检测变得更加方便、GX，并有助于抗COVID-19药物的进一步研究和检测。

       六种化合物的分子结构如下：

瑞德西韦

磷酸氯喹

法匹拉韦

洛匹那韦

沙奎那韦

利托那韦

1、适用范围

       本方法适用于瑞德西韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、洛匹那韦、沙奎那韦、利托那韦6种潜在ZLCOVID-19药物的检测。

2、标准溶液的配制

       单标储备液：磷酸氯喹溶于甲醇:水(1:1 v/v)混合溶液中，瑞德西韦、法匹拉韦、洛匹那韦、沙奎那韦、利托那韦溶于甲醇溶液中。

       单标中间液：将各单标储备液配置成4 mg/mL的中间液，稀释液为甲醇。

       混合标准工作液：各单标浓度见表一，稀释液为流动相。

3、色谱条件

       色谱柱：Endeavorsil^® 1.8 μm C18, 100 × 2.1 mm(Cat＃: 87003)

       液相系统：Agilent 1290 Infinity UPLC、AB SCIEX 4000 + MS

       流动相：A:0.1％甲酸水溶液   B:0.1％甲酸乙腈溶液 

       流速：0.2 mL/min  

       进样量：1 μL

       温度：30 ℃

       扫描方式：ESI +

       梯度设置：

4、检测结果

图1六种化合物检测TIC图

图2 六种化合物标准溶液的MRM色谱图

表1六种化合物检测参数和结果

       利用Endeavorsil^® 1.8 μm C18色谱柱，6种潜在ZLCOVID-19药物能够在4.5分钟内实现完全分离 (图1)。表1列出了洗脱顺序、样品浓度、保留时间、离子对信息。

5、结论

　　本文提供了一种有效的同时检测6种潜在ZLCOVID-19药物的方法，其优点包括：流动相简单、分析速度快、灵敏度高和色谱峰形良好。据检索，本方法为国内外shou次利用LC-MS/MS同时分离、测试和确证6种潜在ZLCOVID-19药物的检测方法。迪马科技希望本方法能够为COVID-19ZL药物在研发、生产以及临床试验等阶段的常规测试中提供强有力的技术支持。

６、相关产品信息

       LC-MS/MS法同时测定6种潜在ZL新型冠状病毒肺炎药物相关产品信息：

2019-nCov新型冠状病毒全封闭超敏数字PCR检测解决方案

北京深蓝云生物科技有限公司针对2019-nCov新型冠状病毒，为您提供过国家权威机构验证的超敏数字PCR定量检测方案，高度特异，且高度灵敏。

该方案基于：

·  Naica 自动化微滴芯片式数字PCR系统。

·  qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix：高品质一步法预混液。

·  引物和探针序列：参考ZG疾病预防控制ZX病毒病预防控制所提供序列，可自行合成，也可以联系深蓝云技术人员进行合成。

·   KeyproTM KP-100生物污染快速净化仪。

通过对一步法反转录-digital PCR结合TaqMan探针方法，只需再扩增试剂中加入RNA模板，即可直接获得病毒RNA拷贝数浓度。针对2019-新型冠状病毒：新型冠状病毒的开放读码框1ab（open reading frame,ORF1ab）；核壳蛋白（nucleoprotein，N）基因区域两个区段进行定量检测。 

工作流程

整个检测过程在Naica 自动化微滴芯片式数字PCR系统中全封闭完成，只需加入RNA样本的反应液加入到Sapphire芯片中，上机即可自动化进行扩增过程。

·无需标准品和标准曲线：直接对RNA/DNA定量。

·检测速度快：2.5小时即可完成样本检测。

·有效微滴数量多：~25000个/样本，超敏jing准，可多孔合并分析，微滴越多越jing准。

·动态范围宽：0.2-20000cp/μL，低浓度低丰度样本直接检测。

·数据可靠：自动质控和可视化微滴溯源。

·自动化操作：一步上样，上手容易，人为误差小。

·唯yi耗材，系统零维护，管理方便。

KeyproTM KP-100生物污染快速净化仪5min可将所用移液器和耗材等表面的RNase进行失活处理。同时可以3-5min对病原体进行灭活，防止实验用品导致实验结果污染和环境污染。

货号和订货信息：

另有病毒RNA提取试剂提供：

北京深蓝云生物科技有限公司同时还提供美国Azure Biosystems的高品质荧光定量PCR IRIS Real Time PCR系统。

IRIS多通道荧光定量PCR系统可实现在线集中数据处理和监控，多机联用，3/6荧光通道，无需ROX校正。

联系方式：

公司名称：北京深蓝云生物科技有限公司
联系电话：010-57256059
E-mail：info@cycloudbio.com

全封闭Naica数字PCR新型冠状病毒超敏检测方案

Cycloud与MicroFuture合作

深蓝云生物科技与北京微未来科技，基于国家疾控ZX和WHO推荐区域，针对2019新型冠状病毒的四段保守序列作为检测靶标，开发超敏的数字PCR检测方法和快速的定量PCR检测方法。

【图源：北京微未来科技】

区段分别为：RdRP基因（特异性靶点），E蛋白基因，N蛋白基因，保守基因S区位点。确保对2019新型冠状病毒鉴定的高度特异性和灵敏度。      

与人冠状病毒HcoV-229E、 HcoV-HKU1、 HcoV-OC43、 HcoV-NL63等型无交叉。

深蓝云生物科技以专业服务科学为使命，愿所学，以致用，共战病毒！

北京微未来科技有限公司以“解码病原微生物，致力于传染病防控”为企业使命。与北京深蓝云生物科技共同在病毒的超敏检测的数字PCR方法展开深入合作。 

联系方式：

公司名称：北京深蓝云生物科技有限公司
联系电话：010-57256059
E-mail：info@cycloudbio.com

细胞因子风暴综合征（Cytokine Storm Syndrome，CSS）

       细胞因子风暴综合征Z早1952年被Farquhar和Claireaux在家族性噬血细胞淋巴组织细胞增生症（fHLH)描述。在之后的五十年里研究并不多。直到2002年SARS开始，CSS引起多器官功能不全（MOF），导致极高的致死率，才再次引起了广泛关注。之后H7N9，H5N1，包括Z近的2019-nCov，都有不同程度的CSS，因而CSS研究文章指数发展。

       CSS的标志是一种不受控制和功能失调的免疫反应，涉及淋巴细胞和巨噬细胞的持续激活和扩增，它们分泌大量的细胞因子，导致细胞因子风暴。

新型冠状病毒病人临床细胞因子风暴特点

       1月24日，ding级医学杂志柳叶刀在线发表文章，系统阐述武汉新型冠状病毒感染病人临床特点。通讯作者为中日友好医院肺危重症医学科曹彬教授和ZG医学科学院和北京协和医学院病原生物学研究所王建伟教授。（文章：Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China，In Press, Corrected Proof, Available online 24 January 2020。）

       文章阐述：虽然2019-nCov和MERS，SARS都属于冠状病毒，但是其细胞因子风暴特点不同，具体如下：

       SARS：病人血清中促炎细胞因子（如IL-1b、IL-6、IL-12、IFN-γ、IP-10和MCP-1）的增加与SARS患者的肺部炎症和广泛的肺损伤有关。

       MERS：MERS-Cov感染引起促炎细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-15和IL-17）浓度升高

       2019-nCov：

       初期：IL1B, IL1RA, IL7, IL8, IL9, IL10, basic FGF, GCSF, GMCSF, IFNγ, IP10, MCP1, MIP1A, MIP1B, PDGF, TNFα, 和 VEGF，均有升高。IL5, IL12p70, IL15, Eotaxin, 和RANTES无改变。

       ICU（重症）和非-ICU病人（轻症）比较：IL2, IL7, IL10, GCSF, IP10, MCP1, MIP1A, 和 TNFα升高. 

       机制：IL1B, IFNγ, IP10,  MCP1激活Th1，GCSF, IP10, MCP1, MIP1A,和TNFα与疾病严重程度相关。与SARS-Cov不同，YZ免疫的Th2细胞因子IL-4,IL-10在2019-nCov也升高。

Ella Simple ELISA系统特点

       全自动：无需人员值守

       Z快速：从样本前处理到结果 1.5小时

       高灵敏：比传统ELISA高10-100倍

       宽动态范围：5个数量级，比ELISA高2个数量级

       组合灵活：8因子panel，4因子panel，单因子灵活选择

Ella Simple ELISA细胞因子风暴Panel

       更多Ella Simple ELISA细胞因子风暴Panel，请联系ProteinSimpleZG

（来源：ProteinSimple）

摘要

基于细胞的体外预测模型可能支持国际上开发新疫苗和其他治疗肺相关疾病（如 COVID-19、慢性阻塞性肺病或特发性肺纤维化）的努力。将3D生物制造与气液界面培养相结合，可以对组织模型进行工程改造，从而在体外重现健康和患病状态下呼吸道的典型特征。这些模型不仅提供了深入了解病毒与靶位点宿主细胞相互作用的潜在机制的机会，而且还有助于减少未来研究中使用的动物数 量，从而支持 3Rs（替换、减少和细化）原则。在这项研究中，我们描述了 3D 生物制造气道上皮模型的生成及其生理相关性的评估。该模型的特点是血管紧张素转换酶 2(ACE2) 的表达，ACE2 是冠状病毒内化所需的一种蛋白质。 ACE2蛋白定位于顶膜表明上皮细胞是极化的，粘蛋白5AC蛋白的存在表明该模型可以产生气道表面液体，这是气道上皮细胞的一种生理功能。因此，这些生物工程组织模型可用于开发不同的疗法和疫苗。

介绍

2019年底出现的新型冠状病毒病（COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的。 该病毒具有高度传播性，并使用血管紧张素转换酶 2 (ACE2) 作为主要受体进入哺乳动物细胞。ACE2 是一种细胞表面蛋白，存在于许多细胞和组织中，包括肺、心脏、血管、肾脏、肝脏和胃肠道(Hamming, 2004)。 ACE2 在健康肺组织中适度表达，在慢性阻塞性肺病 (COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、哮喘、糖尿病和高血压等病理状况中高度表达 (Saheb Sharif-Askari, 2020)。 众所周知，SARS-CoV-2 会感染呼吸道并传播到整个人体，导致多器官感染症状（de Melo，2021 年）。 因此，由于病毒对人类健康的严重影响，开发新的诊断方法、疫苗和抗病du药物迫在眉睫。

图 1. (A) 使用 CAMotics 的 3D 生物打印模型图示，俯视图（左）和侧视图（右）。 (B) 3D 生物打印肺组织模型转移到 Transwell 插入物。

体外模型对于了解疾病机制以及在临床试验前验证治疗方法至关重要。 尽管目前的 2D 培养模型在筛选病毒复制、感染和药物筛选方面很常见，但它们无法概括组织的复杂性和生理学。 然而，像 3D 生物打印技术这样的新平台可以生成在分子组成、生物力学和复杂性方面更类似于原位组织的组织模型（Singh，2020；Seyfoori，2021）。 这些 3D 生物打印模型可以更好地了解类似于人体器官的微环境中潜在的宿主-病原体相互作用，从而有助于筛选针对肺部疾病（如COVID-19）的药物。

在这项研究中，我们专注于生物打印原代人支气管上皮细胞或 Calu-3 细胞以生成气液界面 (ALI) 模型。Calu-3 是一种分化良好且具有特征的细胞系，来源于人支气管黏膜下腺 (Zhu, 2010)。 人肺的黏膜下腺是气道表面液体、粘蛋白和其他免疫活性物质的主要来源。

生物打印的肺病模型在 Transwell 插入物中培养 14 天，并对 ACE2 和粘蛋白 5AC (MUC5AC) 蛋白进行免疫染色。 使用本应用说明中介绍的实验装置，可以研究宿主-病原体与 SARS-CoV-2 和气道上皮细胞的相互作用（Zhu，2010）。

图 2. 第 7 天 (D7) 和第 14 天 (D14) 肺组织模型在 10 倍放大时的 H&E 染色。 位于构建体顶部的 Calu-3 和 HBE 细胞的上皮层。 比例尺=100 µm。

材料和模型

细胞准备

在肺组织模型中使用了两种不同的上皮细胞类型：人支气管上皮细胞（HBEpC；C-12640，PromoCell）和 Calu- 3（肺腺癌细胞衍生的上皮细胞；HBT-55，ATCC）。人肺成纤维细胞（HPF；C-12360，PromoCell）用作支持细胞。 在根据各自制造商的协议进行生物打印之前，将细胞解冻并在 2D 中扩增。 HBEpC在气道上皮细胞生长培养基（C-21060，PromoCell）中培养，HPF在补充有生长培养基2试剂盒（C-23020，PromoCell）的成纤维细胞生长培养基2中培养，分别用于第4代和第9代； 而 Calu-3 细胞在补充有 10% 胎牛血清 (FBS; 10270106, Gibco Thermo Fisher Scientific) 和 1% 青霉素-链霉素-新霉素混合物 (PSN; 15640055，Gibco Thermo Fisher Scientific）并用于第 4 段。

肺组织模型的生物打印

肺模型被设计成一个圆盘，底部有一个实心层，顶部有一个 5 层边缘（图 1A、1B）。 这样做是为了促进接种后上皮细胞的包埋。 该磁盘是用 GelMA-Laminin 521 (GelMA-LN521, CELLINK) 3D 打印的。 接下来，将 2 x 106 HPF 用胰蛋白酶消化、洗涤、收集、旋转并轻轻重悬于 100 µL 成纤维细胞培养基 2 中，然后将其小心地混合到1mLGelMA-LN521生物墨水中，预热至37°C并转移到琥珀色墨盒中（ CSO010311502，CELLINK）。 为了去除截留的气泡，将嵌入 HPF 的 GelMA-LN521 滤芯以 460g 离心 1 分钟。 在开始打印会话之前，将墨盒安装在 BIO X™ 生物打印机中设置为 27°C 的温控打印头（00000020346，CELLINK）中 20 分钟。 将药筒倒置 2 至 3 次以避免细胞沉淀。 GelMA-LN521 生物墨水的合适生物打印温度为 26°C 至 27°C。然后在 12 孔板中使用温控打印头在 27°C 下对圆盘篮进行生物打印。 首先使用 405 nm 光固化模块（距离设置为 5 厘米）对每个构建体光固化 12 个圆盘复制品，并将成纤维细胞生长培养基添加到每个孔中。 然后在添加上皮层之前，将圆片在成纤维细胞生长培养基中于 37°C 孵育 3 天。

图 3. HBE 细胞中 ACE2 的免疫染色。 在 ALI 培养的构建体上不同天的 ACE2（绿色）和细胞核染色 DAPI（蓝色）。 比例尺=100 µm。

增加肺上皮层

对于上皮层，将 HBE 或 Calu-3 细胞分别重悬于气道上皮生长培养基或 MEM 完全培养基中，并补 3充 5 ug/mL LN521。将 150K 细胞/cm2 接种在每个圆盘的顶部。从孔中取出成纤维细胞培养基，将5 x 105 个细胞重新悬浮在 360 μL 的完全培养基中，并在每个圆盘的顶部添加 30 μL 的细胞悬浮混合物。接种后将构建体留在工作台上 10 分钟，然后转移到培养箱中再放置 20 分钟以使细胞附着在生物打印盘上。将 HBE 构建体以 1:9 的比例轻轻浸入成纤维细胞和气道上皮培养基的混合物中；将 Calu-3 构建体以 1:9 的比例浸入成纤维细胞和 MEM 培养基的混合物中。浸没培养物在37°C、5% CO2 下生长 4 天，然后转移至 ALI 培养物。 ALI 培养是通过将结构转移到 Transwell 插入物中来建立的，该插入物补充了适当体积的相同介质，如上所述（图 1B）。培养基每 2 至 3 天更新一次。

图 4. Calu-3 细胞中 ACE2 的免疫染色。 细胞在 ALI 培养物中的 GelMA-LN521 上生长。 在第 7 天 (D7) 和第 14 天 (D14)，对细胞进行固定、切片和 ACE2 染色（绿色）。 使用 DAPI（蓝色）可视化细胞核。 构建体在明场中可视化以查看 ALI。 比例尺 = 100 µm。

分析

根据 CELLINK 的固定方案，在第 7 天和第 14 天（ALI 培养）收集样本，并在 4% 多聚甲醛 (PFA) 中固定进行组织学染色。 然后将样品包埋在石蜡中，按照 CELLINK 的切片协议，使用切片机获得10 µm 切片。 按照 CELLINK 的免疫荧光方案并使用 Alexa Fluor 488（A-11029，Thermo Fisher Scientific）作为二抗，对切片进行 ACE2（MAB933，R&D Systems）和 MUC5AC（AB3649，Abcam）染色。 样品也按照 CELLINK 的方案进行了 H&E 染色。 所有协议都可以在 CELLINK 网站的 Support 选项卡下找到。

图 5. HBE 细胞中粘蛋白的免疫染色。 细胞在 ALI 培养物中的 GelMA-LN521 上生长。 在第 7 天 (D7) 和第 14 天(D14)，细胞被固定、切片并染色 MUC5AC（红色）。 使用 DAPI（蓝色）可视化细胞核。 构建体在明场中可视化以查看ALI。 比例尺 = 100 µm。

结果与讨论

用于生成肺组织模型的制造方法创建了一个完整且坚固的构造，在整个实验过程中保持其形状。 样品横截面的H&E 染色显示，接种在构建体顶部的 Calu-3 和 HBE 细胞在第 7 天形成了紧密的单层。然而，在第 14天，Calu-3 细胞形成了厚的多层上皮样 结构，而 HBE 细胞仍然保持薄的单层（图 2）。 这表明初级支气管上皮细胞保持了接触抑制，这种抑制在癌细胞中丢失，导致细胞相互重叠生长。

图 6. Calu-3 细胞中粘蛋白的免疫染色。 细胞在 ALI 培养物中的 GelMA-LN521 上生长。 在第 7 天 (D7) 和第 14 天 (D14)，细胞被固定、切片并染色 MUC5AC（红色）。 使用 DAPI（蓝色）可视化细胞核。 构建体在明场中可视化以查看 ALI。 比例尺 = 100 µm。

接下来，我们对 ACE2 进行了免疫染色，ACE2 是一种参与冠状病毒内化的细胞表面蛋白。在 HBE 样本中，在第 7 天单层中很少有细胞对 ACE2 进行染色，而在第 14 天，在许多细胞中检测到 ACE2 染色（图 3）。与HBE 不同，Calu-3 样本中的大多数细胞在第 7 天和第 14 天都对 ACE2 进行了染色（图 4）。此外，在顶端膜域（ALI 培养中的空气表面）观察到 ACE2 的免疫染色，如在第 14 天样品中朝向顶部 Calu-3 细胞的局部绿色信号所见（图 4），表明细胞层是极化的。这些数据一起表明，我们的 Transwell 模型显示了极化的气道上皮细胞，在原代细胞和癌症衍生细胞中都表达了 ACE2。

为了进一步表征模型，我们对 ALI 培养结构中的粘蛋白进行了免疫染色，因为据报道 MUC5AC 是由气管支气管表面上皮中的杯状细胞产生的 (Kesimer, 2009)。我们在 ALI 培养模型中观察到 MUC5AC 在 HBE 和 Calu- 3 细胞中的表达（图 5、6），表明细胞已经分化。我们的数据共同表明，这里介绍的 3D 生物制造模型将为设计 3D 肺组织模型提供一个极好的工具，以快速筛选针对 COVID-19 的生物制剂。这也将有助于减少动物研究，从而支持 3R 原则。

结论

该研究表明，3D 生物打印与 Transwell 细胞培养相结合可用于生成复杂的体外肺上皮模型。

* 体外 ALI 模型显示 ACE2 和 MUC5AC 蛋白的表达。

* 原代支气管上皮细胞在整个实验过程中保持紧密的单层，而 Calu-3 细胞在第 14 天形成多层上皮。

* 与腺癌细胞来源的 Calu-3 细胞系相比，ACE2 在原发性支气管上皮细胞中的表达中等。

* ALI 培养中生长的细胞变得极化，如培养物顶膜上 ACE2 的表达所见。

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