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大家好，CELLINK又与大家见面啦！

今天咱们来聊聊，吃瓜群众们关于3D生物打印这个领域的初印象：打印器官？好科幻啊！这项技术真的可以成为现实吗？

小编将与你分享生物打印的起源与趋势！

di一台生物打印机是科学家们在2003年制成的，自那以后，生物打印领域迅速发展 - 预计到2026年其市场价值规模将超过40亿美元。

这项新兴的革命性技术似乎有着不可预知的未来。今天，我们请到我们的应用工程师拉胡尔·罗伊（Rahul Roy），为你解说生物打印的潜力，将真相与科幻区分。

完整的器官在不久的将来就能打印了吗? 还需要多远的路？

拉胡尔·罗伊：“不久”是相对的。在研究中器官将在10年内打印出来，但在这段时间内肯定不能用于临床。问题的一部分在于如何将生物材料转化为组织，还有由于细胞投资导致打印器官非常昂贵的事实。即使是非常小的毫米级立方体也要花费数千美元。

挑战依旧存在，我们如何准确有效地创造出能模拟我们身体的组织?关于价格，就像任何技术一样，人们正在学习新的方法来提高细胞培养的成本效益性。

人工智能能帮助我们复制大脑和身体的结构吗?

拉胡尔·罗伊：人工智能肯定会在生物打印的未来发挥重要作用。

我们需要了解细胞骨架如何接收来自身体的信号，以及骨架内的材料如何转化为组织。这就是组织工程的核心--学习如何将骨架转化为组织。涉及的因素有很多，所以很难理解这种关系。人工智能将帮助我们更准确地理解这些模式和关系。

在临床中，我们可以使用人工智能检查患者，了解他们的组织并创建正确的生物材料配方和几何形状，以确保骨架在体内良好工作并正确发育。

生物打印会创造出一种可持续的肉类替代品吗?

拉胡尔·罗伊：毫无疑问！这将成为理解我们如何培育有说服力的美味肉类的必要条件。理解我们的肌肉如何发育所面临的挑战对于理解我们如何制作不同的牛排来说非常重要。

生物打印可以制作纯素皮革或鳄鱼皮吗？

拉胡尔·罗伊：当然，绝对的。这是一件非常具有挑战性的事情，创造鳄鱼皮的纹理– 这可能会融合许多不同的技术 - 但生物打印肯定会有所贡献。皮革可能更容易制造。它可以通过生物打印皮肤和传统的鞣制技术来实现。

最后，当谈到生物打印的未来，你最希望的是什么?

拉胡尔·罗伊：我最希望未来可以发现治疗我们认为不可治愈的疾病的疗法 - 阿尔茨海默氏症、帕金森病、癌症等。我为那些可以被治愈的人们感到高兴。能够为这些应用领域提供研究工具是令人兴奋的。

尽管这一前沿领域存在许多问题，但有一点是明确的:生物打印技术将改变多个行业可能的定义。它无可否认地将为研究人员解锁健康未来的有效工具，并为人类带来帮助与突破。

你还认为这只是科幻吗？

如果对3D生物打印感兴趣，欢迎随时联系我们，我们能为您展示最前沿的3D生物打印技术哦！！

早在两年前，Tal Dvir课题组就曾在Advanced Science杂志发表重磅论文[1]，成功打印出具有生命活性的心肌贴片以及心脏类器官模型。当时Tal Dvir课题组从病人体内提取出网膜组织，将其一部分去细胞后制备内源性水凝胶，作为打印墨水的基材；将另一部分重编程（Reprogramming），使其重新分化（Differentiation）成心肌细胞和内皮细胞。搭配上述的内源性水凝胶和牺牲材料明胶，成功制备出心肌细胞和血管成型细胞两种生物墨水，并在regenHU的生物3D打印机上成功打印出心肌贴片和心脏类器官。该技术可帮助具有心脏缺陷的病人替换缺陷组织，减轻病情甚至使病人康复。

图1：3D Printing of Personalized Thick andPerfusable Cardiac Patches and Hearts一文的实验思路

近日，Tal Dvir课题组更进一步，又在Advanced Science杂志上发表了一篇生物3D打印心肌贴片的文章[2]。在该文章中，作者创新性地在心肌贴片上植入柔软可拉伸的电路，使得人为向心肌贴片提供电信号成为可能。

为了达到该目标，作者同时使用三种不同的墨水：心肌细胞墨水、导电材料墨水和绝缘材料墨水。心肌细胞墨水与上一篇文献类似，将心肌细胞悬浮于含细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）的水凝胶中。导电材料墨水则是将石墨薄片（Graphite Flakes）悬浮于液态聚二甲硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）中，石墨薄片提供导电性，PDMS则提供类似水凝胶的基材质地。绝缘材料墨水为PDMS本身。为了使疏水的PDMS与亲水的水凝胶能够更好地结合，作者在PDMS中加入了表面活性剂Span 80。

空有材料还不够，其导电性能必须达到要求。课题组为了获得较佳电导率，测试了不同浓度的石墨薄片PDMS悬浮液。由测试可知，当石墨薄片的浓度在45%时达到较高电导率，超过0.3 S/cm（图2）——这一数值尽管与铜丝仍有一定距离，但石墨薄片的可塑性使得在该文献中成为较好的选择。另外，为了适应心肌细胞收缩时带来的形变，打印出来的电路必须经受住一定次数和程度的形变。通过力学测试可获知，悬浮有石墨薄片的导电材料墨水在成型后能够达到40%以上的延展性，并且能够承受至少1000次的反复拉伸和弯曲（图3）。

图2：不同石墨薄片浓度下导电墨水的电导率比较

图3：a）导电墨水打印成八字试块（Dog-bone-shaped Samples）测试力学性能；b）绝缘墨水（PDMS）与导电墨水（Graphite in PDMS）的力学性能对比，绝缘墨水的延展性更好，但承受的最大拉力不如导电墨水；c）1000次拉力测试中的最后10个循环的延展性和阻力值；d）1000次弯曲测试中的最后10个循环的延展性和阻力值

得益于这种柔软可拉伸的电路，医护人员可以从人体外部提供适当的电信号，引导心肌细胞执行相应的功能，甚至可以通过给予脉冲式的电流，使该心肌贴片担任起搏器的功能，医生可以远程让心脏重新开始收缩。

图4：带有电极的心肌贴片（比例尺：2 mm）

[1] Nadav N, Assaf S, Reuven E, et al. 3D Printing of Personalized Thick and Perfusable Cardiac Patches and Hearts[J]. Advanced Science, 2019, 6, 1900344

[2] Asulin M, Michael I, Shapira A, et al. One Step 3D Printing of Heart Patches with Built-In Electronics for Performance Regulation[J]. Advanced Science, 2021, 8, 2004205.

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点击以下链接，查看往期回顾

生物3D打印应用 | 缓释复合成分药片

生物3D打印应用 | 打印高载药量速释片剂

生物3D打印应用 | 构建体外肝毒性模型

生物3D器官打印——人工角膜

生物3D器官打印——肠道体外模型

生物3D器官打印——喉部软骨

近几十年来，随着YL条件的提升、人均预期寿命增加，许多因身体条件变差而逐渐产生的“老年病”变得越来越常见。许多老年患者每天可能都需要服用多种药物，且药片的体积对于老年人而言不易吞咽。在2020年11月的推文《生物3D打印应用 | 打印高载药量速释片剂》中，我们介绍了Clive J. Roverts课题组如何使用生物3D打印提升载药量，从而减少药片体积，使其更易于吞咽。今天，我们将侧重于另一个方面，即如何克服同时服用多种药物的难题。

口服药片是所有药物当中最为常见也是最为方便的一种剂型。但口服药片往往通过批量生产完成，所以难以根据患者进行定制（与之相反，注射剂往往根据医生的CF由护士在现场进行配制，具有一定程度的灵活性，但需要定点给药、扎破皮肤，所以便利性不如口服药片）。因此，如果能将多种药物整合到一粒药片中，将大大减少服药患者的压力。



针对该问题，依然是Clive J. Roverts课题组，使用regenHU生物3D打印机技术，成功打印出复合活性成分片剂。这些活性成分并不是简单地混合在一起被压制成片剂，而是各自具有一个“舱室”，通过调整舱室外壁和药物本身的性质，就可以分别控制各个成分的释放速率。在文中，这项技术被称为聚合药片（Polypill）。通过3D打印技术制作这种新型的聚合药片，就可以实现真正的“个性化给药”。

图1：聚合药片的结构、作用示意图

在文中，作者使用硝苯地平（一种常见的降血压药物）、卡托普利（在文中作为降血压药物）、格列吡嗪（II型糖尿病降血糖药物）阐述“聚合药片”的设计。如图1所示，卡托普利在打印过程中被多孔膜材料包裹，服用后将以渗透的方式释放药物；硝苯地平与格列吡嗪则三边被包裹多孔膜包裹，另一面暴露在外，服用后将以溶出的方式释放药物。两层之间是顺滑的粘性材料，服用后将被溶解，使两层分离。两种释放方式均有缓释效应，因而三种药物在实验过程中，释放半衰期几乎都在14 h以上。

图2：聚合药片成品图

获得成品（图2）后，作者分别进行了扫描电镜、药物释放动力学等表征或检测。扫描电镜展示了多孔膜在溶出前后的变化（图3）；药物释放动力学的模型匹配显示以渗透方式释放的卡托普利为零级反应，以溶出方式释放的硝苯地平与格列吡嗪则为一级反应。另外，课题组通过重量成分均一度检测3D打印方式是否能够保证批次内药片质量的稳定；通过红外光谱检测各舱室的成分，保证不同舱室间没有发生“污染”。

图3：药片中的多孔膜在溶出前（上两图）和

后（下两图）的表面SEM图像

文章中对于复合成分药片的制作方法无疑具有较大的积极作用。目前，如果一位老年患者同时患有高血压和糖尿病，可能不得不分别服用这三种药物。一天多次的频率、每次五六颗的药量都会让老年患者感到严重不适。但如果该聚合药片得以成熟商业化，患者的服药压力将会大大降低。

参考文献

[1] Khaled S A, Burley J C, Alexander M R, et al. 3D printing of tablets containing multiple drugs with defined release profiles[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2015, 494(2): 643-650.

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从坚硬的骨骼到柔软的脂肪，从微细的毛细血管到整个大脑，我们的细胞形成多种组织类型的能力是组织工程学中最引人入胜ZJ挑战性的方面。为了重现人体的复杂性，组织工程师将不得不利用各种3D生物打印技术来替代当前的“一刀切”解决方案。这篇文章解释了CELLINK提供的两种台式三维（3D）生物打印解决方案的优缺点-挤出型生物打印机BIO X™和INKREDIBLE™，以及轻型DLP光固化生物3D打印机Lumen X™（由Volumetric技术驱动），特别是比较每种材料的力学、分辨率、几何形状和材料兼容性。

打印机制

两种生物打印技术均始于计算机辅助设计（CAD）文件，该文件被切成离散的水平层，然后由打印机进行构建和堆叠以生成3D构造。不同之处在于每种方法如何处理这些层次。

对于基于压力挤出式的生物打印，更常见的技术是将糊剂或液体装入安装在龙门架或机械臂上的墨盒中，该墨盒沿打印床或表面上方的笛卡尔坐标移动，从而在其上进行打印。机械力通常是气压或电机驱动的活塞，将材料推过喷嘴以形成细丝。通过在表面上拖动细丝，龙门架跟踪DY层的轮廓。然后按照用户的要求，门架继续以填充图案逐层沉积细丝，以建立孔隙率和机械强度，直到完成打印为止。

基于数字光处理的立体平版印刷术（基于DLP的SLA）也是逐层过程，但是代替通过喷嘴挤出材料，照明源与电影放映机不同，它使用静止图像处理每一层。将此图像投影到光敏液体的浴液或液滴中会刺激化学反应，从而导致液体仅在照明时固化或固化。将这些固化层堆叠在构建平台上可产生打印对象。

解析度

在讨论打印技术时，通常将分辨率或最小的理论上可打印的细节进行比较，这由许多因素（例如材料和几何形状）决定，而这些因素不在本文的讨论范围之内。我们的比较集中于沿X和Y轴的平面分辨率。在基于挤出的生物打印中，喷嘴的直径决定了可以挤出的长丝的直径。在基于DLP的SLA中，投影像素的大小定义了可以固化的最小光点。该光点通常小于大多数挤出喷嘴直径，并且化学反应更加一致，从而使基于DLP的SLA印刷技术能够以比挤出生物印刷更高的分辨率产生更小，更复杂的物体。细丝离开挤压式生物打印机的喷嘴后，除了重力和摩擦力之外，没有任何东西可以控制细丝的放置和散布方式，从而导致沿细丝边界的某些变化。即使使用与基于DLP的投影机的最小光点大小相同的灯丝，在这种可变分布的情况下，挤出的印刷品看起来也会比SLA印刷的结构粗糙。

微流体应用

由于挤出的印刷品基本上是圆柱状的堆积物，例如舱室原木，因此长丝之间的接触面积很小。当这些堆叠的圆柱体本身以类似于血管的管状形式布置时，小的接触面积使得难以确保该管是水密的并且足够坚固以承受流经其的流体的压力。另一方面，基于DLP的SLA则将印刷材料的薄片夹在中间，基本上从一边到另一边都是粘在一起的，从而产生明显更坚固，不透水的结构。基于DLP的SLA具有更坚固的管子和更光滑的侧面，非常适合生物打印芯片实验室微流体设备，尤其是那些具有复杂网络的设备或需要在显微镜下成像且无畸变的设备。基于DLP的SLA在打印复杂的负面特征（如网络）时的优势也有助于其打印复杂的正面特征（如网格）的能力。

控制孔隙率

组织工程支架需要在各个维度上均具有特定的孔隙率和形状，以匹配天然组织并允许细胞存活，但是挤出生物打印机仅在填充线之间的负空间内即可形成孔隙率。如图1所示，使用挤压打印机打印立方体时，用户可以选择一定百分比的六边形填充物，然后机器将在立方体内打印垂直对齐的六边形。

图1. 立方体的挤压3D打印。 A）立方体的CAD模型，B）显示周长（黄色）和填充（红色）路径的切片图像，C）挤压的立方体。

挤出切片机着眼于对象的外部边界时，基于DLP的SLA切片机以100％填充的方式在单个图像中捕获层的整个平面，因此必须在原始模型中创建所需的任何孔隙率。 尽管这可能会带来前期的复杂性，但许多CAD套件仍可以将格子图案应用于对象，例如图2中的立方体。

图2. 基于DLP的多维数据集的3D打印。 A）具有螺旋状结构的立方体的CAD模型，B）将被投影到感光材料上的切片的图像，C）印刷的螺旋状立方体（右）。

组织（如骨骼）在三个维度上具有孔隙和几何形状，因此能够生成并打印重复的晶格或随机3D结构将产生更好地模仿生理组织的支架。基于逐丝挤出的方法具有固有的易碎性，使得像图2中的结构那样几乎不可能打印网格。另外，在挤压结构中，孔隙是垂直存在的，而水平孔隙则出现在层之间，因此是有限的或不存在的。考虑到每种技术的不同优势，用户必须为其设计考虑最适合的生物打印方法。虽然挤压提供了简化的设计和打印过程，使其非常适合于访问CAD软件受限或刚刚起步的实验室，但基于光的生物打印技术目前是再现人体最小，最复杂结构的ZJ选择。但是形状和大小只是组织工程难题的一部分。

选择材料

如果器官由一种材料和一种细胞类型组成，则生物打印器官将容易得多，但是适当地重建器官意味着捕获不同细胞类型的空间排列。挤压打印机可以在龙门架上排列任意数量的墨盒，从而可以逐个细丝地排列材料和细胞，从而精确地模拟体内环境。相比之下，基于DLP的SLA浴通常是一种材料和一种细胞类型。已经进行了多种尝试来执行多材料SLA打印，其中材料或单元类型的布置无关紧要；然而，这些尝试通常涉及缓慢，重复的清洁步骤，并且存在洗涤液之间或从一种材料到另一种材料之间交叉污染的风险。挤出不仅可以进行多种材料的生物印刷，而且还可以使用多种材料进行印刷。

将流体推入药筒的简便性，使组织工程师在挤出液化然后固化的材料之前和之后都具有创造力和灵活性。挤压材料的几乎无限可能解释了BIO X可用的打印头的多样性，使研究人员可以在单张打印中组合多种材料和单元类型。顾名思义，基于光的生物打印技术（例如在Lumen X中发现的基于DLP的SLA）使用感光材料和光源来促进固化。感光材料还必须具有足够低的粘度，以便在打印过程中构建平台移入和移出液体时，液滴可以流入液滴。

从力学、分辨率、几何形状和材料选择的角度来看，基于挤压的SLA生物打印机和基于DLP的SLA生物打印机之间存在许多差异。但是每种方法的优点使它们在许多研究环境中具有WM的互补性。挤出技术可以从多种生物墨水调色板中进行多种材料的打印，并提供简化的模型设计，而基于DLP的SLA则可以在高分辨率下实现显着的几何复杂性，并且根据所使用的材料，可以实现WM的清晰度。研究人员还可以在一个实验中结合这两种技术。例如，通过将混合的细胞从BIO X挤出到在Lumen X上印刷的微流体芯片中。无论您选择在工作流程中添加一个还是两个，您都会发现CELLINK提供了可靠的，通用的生物打印解决方案。

背景

骨骼肌作为人体内最丰富的组织器官，在人体各处均有身影，重量更是占到了人体的20 – 50%。得益于丰富的骨骼肌，我们能够顺利完成各种动作，成为“动”物。正因为骨骼肌如此重要，与之相对的疾病——肌肉萎缩对于生活的影响也十分严重。同时，缺乏有效的医疗药物也让该类疾病变得十分棘手。药物开发正在进行，然而现行的开发过程费用高、时间久、成功率低，使得患者不能心理上难以承受长期且不稳定的研发等待。因此为了提高临床前的药物筛选效率，3D微生理系统（Micro-physiology systems，MPS）——一种在培养皿上模拟人体生理和疾病效果的技术——逐渐被科研人员所重视。Angela Alave Reyes-Furrer等人便是在此技术上，通过生物3D打印的方式，在体外构建骨骼肌模型，希望能够用于药物筛选。

方法

作者使用瑞士regenHU生物3D打印机3DDiscovery的电磁阀喷墨打印头完成主要的打印工作。相比于经典的挤压打印方式，微型电磁阀喷墨能够有效减少打印时的剪切力，提高细胞存活率。因使用的基质胶（Matrigel）具有低温流动，高温凝固的特性，因而在打印机上搭配了水循环制冷系统，确保打印材料在低温（＜10℃）环境下喷出。使用的生物墨水分散有原代人肌肉前体细胞，打印后培养一周形成可收缩、有纹理的肌纤维，即获得了体外骨骼肌模型。期间可观察到模型体积缩小，表明肌肉细胞产生拉力（图1）。

图1 打印后细胞分化过程

结果

作者主要进行了刺激反应和收缩力两方面的测试。

对于刺激反应，作者给予肌肉模型单次电刺激，模型产生了相应的抽搐收缩（图2）。为了更真实地模拟肌肉工作，作者将单次刺激转为电脉冲系统（Electrical pulse stimulation，EPS），给予连续3 h的脉冲刺激，证实了白细胞介素-6肌因子（Interleukin-6 myokine）的表达和蛋白激酶B肥大通路（AKT hypertrophy pathway）的激活（图3）。

图2 肌肉收到刺激后收缩

图3 EPS诱导（+）的模型AKT肥大通路激活和白细胞介素-6表达于第12（d12）、16（d16）、19（d19）天的情况与控制组（-）对比：a）Thr308磷酸化比例；b）Ser473磷酸化比例；c）白细胞介素-6基因表达。统计方法：未配对t检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

对于收缩力，作者从刺激次数、电流大小、持续时间等方面进行了考察。分别在25 Hz、300 mA、2 ms下获得较大的收缩力值（图4）。随后的进一步实验则添加了常见的肌肉收缩促进剂（Caffeine）和肌钙蛋白激活剂Tirasemtiv（Troponin C activator），发现均能提升肌肉的收缩力（图5）。

图4 电流大小（a）、刺激次数（b）、持续时间（c）对收缩力的影响

图5 Caffeine（左）和Tirasemtiv（右）对于肌肉收缩力的提升。统计方法：未配对t检验，****p < 0.0001。

小    结

作者Angela Alave Reyes-Furrer等人首次在体外使用微生理系统重现肌肉刺激药物对于运动和收缩力地提升，这一技术非常适合于临床前的药物筛选，期待其应用于新型药物开发以医疗肌肉萎缩。

参考文献

[1] Alave Reyes-Furrer, A., De Andrade, S., Bachmann, D. et al. Matrigel 3D bioprinting of contractile human skeletal muscle models recapitulating exercise and pharmacological responses. Commun Biol 4, 1183 (2021). https://doi.org/10.1038/s42003-021-02691-0

      神经母细胞瘤（Neuroblastoma）是儿童、婴幼儿较为常见的一种颅外肿瘤。其典型的特点是后期恶性化程度较高，预后较差。为保证药物具有针对性，提高治愈率，目前推荐的一个策略是在组织模型中确定病人对该药物的特异性反应。因此，构造一个具有肿瘤微环境的特异性组织模型就显得尤为重要。

     目前，构建肿瘤微环境的一个主要难点在于如何触发其形成血管并发生肿瘤血管化（Tumor-vascularization）。已有的尝试主要为结合内皮细胞和间叶干细胞，使其提供支撑作用并在立体水凝胶中形成血管。

       而在该文献中，作者Daniel Nothdurfter等人将生物3D打印与流体芯片（Fluidic chip）相结合，开发了一种全新的灌注和微血管化的肿瘤微环境模型（Perfused and micro-vascularized tumorenvironment model）。在文章中，作者首先使用激光雕刻聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethylmethacrylate，PMMA）薄片，使其中间具有一个圆形孔（模拟肿瘤微环境）、两侧各有两条槽（模拟血管）；同时，使用regenHU生物3D打印机3DDiscovery BioSafety的细胞亲和性打印头以喷墨的方式将含有细胞的水凝胶均匀喷洒在孔及两侧血管槽内，以形成微环境的主体；为保证血管空腔的形成，作者也使用了牺牲材料Pluronic F-127——一种低温呈液态，高温呈凝胶状的材料——结合打印机的挤压式打印头，在凹槽内铺设血管。之后继续用含有细胞的水凝胶覆盖，降温使Pluronic F-127融化流出，即可得到具有空腔、可流经液体的血管结构（图1、图2）。

图1 文中提到的肿瘤微环境模型构建的三个步骤：激光雕刻流体芯片、生物墨水打印、形成可灌注的血管及肿瘤微环境

图2 左：打印Pluronic F-127后的模型；右：降温去除牺牲材料后，使用染色的PBS进行灌注的效果

      根据该模型结构，作者尝试使用一种明胶-甲基丙烯酸酯（Gelatin-methacrylate，GelMA）与纤维蛋白（Fibrin）混合基质搭配多种类型的细胞，模拟肿瘤微环境；同时，通过添加内皮细胞，以促进微血管的自发形成。结果表明，脂肪细胞（Adipocyte）或诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）来源的间充质干细胞（Mesenchymal stem cells）都可以诱导肿瘤微环境的形成。另一方面，在去除牺牲材料的管状结构内表面涂上内皮细胞，可生长成致密的血管组织，形成组织屏障。

       之后作者在打印过程中将患者来源的神经母细胞瘤球状体添加到基质里，并培养超过两周的时，成功展示了微血管被肿瘤球状体吸引并生长的过程（图3）；而肿瘤球状体一旦破裂或无法维持球状，则肿瘤细胞会很快入侵周围的微环境（图4）。

图3 添加了神经母细胞瘤球状体（红）的模型基质，分别在第1、6、12、16天的微血管（黄绿）生长情况（比例尺：200 μm）

图4 肿瘤球状体（红）破裂后在微环境中的扩散情况（比例尺：第一行为200 μm；第二行为50 μm）

       小结：该文献介绍了一种微血管化的神经母细胞瘤的肿瘤微环境模型，其特点在于通过生物3D打印，可进行高度定制；同时结合了流体芯片，使其结构更加稳定、统一，形成了一个中等通量的生物制造平台，有利于开展更为复杂、系统的实验，在未来医疗的肿瘤血管生成和转移研究中也能有很大的发挥余地。

       新一代regenHU生物3D打印机保留上一代高精度、高稳定性优势的同时，提供更为简洁的模块化设计，可根据用户应用方向自行定制独特组合功能。设备整体专为生物打印考量，提供从料仓到打印平台全程的细胞生理温度和无菌环境。如需了解细节，请拨打联系电话：021-37827858 或 13818273779（微信同号）。

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      3D打印的思想源于19世纪末美国研究的照相雕塑和地貌成型技术。在20世纪80年代为了满足科研探索和产品设计的需求，在数字控制技术进步的推动下得以实现，3D打印的相关技术得以积累，并且在业内小规模传播。20世纪90年代中期，出现利用光固化和纸层叠等技术的Z新快速成型装置，它与普通打印工作原理基本相同，打印机内装有液体或粉末等“打印材料”，与电脑连接后，通过电脑控制把“打印材料”一层层叠加起来，Z终把计算机上的蓝图变成实物。

      3D打印通常是采用数字技术材料打印机来实现的。常在模具制造、工业设计等领域被用于制造模型，后逐渐用于一些产品的直接制造，已经有使用这种技术打印而成的零部件。该技术在珠宝、鞋类、工业设计、建筑、工程和施工（AEC）、汽车，航空航天、牙科和YL产业、教育、地理信息系统、土木工程、枪支以及其他领域都有地理信息系统所应用。

       德国Nanoscribe公司的Photonic Professional GT系列仪器是目前世界公认的打印精度Z高的微纳米3D打印机。跟传统的以激光立体光刻为代表的高精3D打印机相比，利用双光子微光刻原理的Photonic Professional GT系列能够轻松打印出精细结构分辨率高出100倍的三维微纳器件。

      不管是在科研领域还是在工业界，双光子加工都被认为是Z具有应用前景的精细加工技术之一。作为市面上双光子加工技术的翘楚，Photonic Professional GT提供了全智能的软件操作界面以及标准化3D作业流程，能够实现多种材料的增材以及减材加工。目前排名前十的大学里已经有六所购买了这台设备（例如哈佛大学，斯坦福大学等），开创或者推动着诸如力学超材料、激光快速成型，微纳机器人，再生医学工程，微纳光学，微机电以及等离激元等多个创新领域的研究。

      纳糯三维科技（上海）有限公司作为Nanoscribe在ZG的子公司加强了在ZG的销售活动，巩固现有业务关系，并在整个亚太地区进一步扩大客户服务范围。

 概述

基于 T 细胞的疗法正在迅速发展成为许多癌症的有效一线ZL选择。近年来， FDA 已经批准了几种针对免疫检查点的ZL性抗体和小分子用于临床，以补充和提高T 细胞的靶向性和有效性。这些免疫检查点YZ剂的临床前筛选需要强大的体外肿瘤模型来评估 T 细胞杀伤效率。但是，传统的 2D 肿瘤模型通常缺乏生物学相关性和复杂性来预测体内或临床结果。 3D 生物打印平台以及许多其他 3D 培养方法，提供了在生理上更相关的组织模型中自动筛选各种分子和药物的潜力。在此，在此概念验证研究中，我们描述了小鼠肺癌的同系生物打印肿瘤模型，以在细胞细胞毒性测定中评估免疫检查点YZ剂（PD-1）。在生物印记的肿瘤中观察到 T 细胞浓度依赖性杀伤， 并且添加免疫检查点抗体进一步增强了 T 细胞杀伤效力。有人建议，生物打印的 T 细胞细胞毒性测定法可能使研究人员能够在更有效的转化模型中筛选检查点YZ剂。

引言

       T 淋巴细胞（T 细胞）在实现对传染病和癌症的长期免疫中起着至关重要的作用。 T 细胞可以在感染或癌细胞表面上的主要组织相容性复合物（MHC）分子的背景下识别特定抗原。这种特异性识别导致 T 细胞分泌有毒颗粒，从而特异性杀死靶细胞。传统上，已经使用在二维（2D）单层中生长的靶细胞进行了 T 细胞杀伤（细胞毒性）测定（Golstein，2018）。这些 2D 分析可通过成像或其他方式快速轻松地进行终点分析。但是，在人体内部，T 细胞介导的靶细胞杀伤发生在三维（3D）环境中，这归因于 T 细胞迁移或渗入 3D 组织核心的其他障碍。因此，3D T 细胞细胞毒性测定法在生理上更相关，并被认为可以更好地预测体内实验的结果。在免疫刺激剂的临床试验中，使用三维肿瘤模型进行细胞毒性试验越来越受到关注。

检查点阻断疗法的ZX发展彻底改变了癌症ZL领域，通过YZ免疫检查点来增强 T 细胞介导的肿瘤细胞杀伤（Topalian，2016）。几种检查点YZ剂，例如抗PD1 和抗 PD-L1 抗体，已被批准用于临床（Sharon，2014 年）。然而，开发高通量 T 细胞毒性测定法以快速和低成本地筛选此类YZ剂的需求仍然没有得到满足。

      已经研究了几种 3D 肿瘤模型，包括球状体、悬滴和微流控芯片模型，用于 T 细胞细胞毒性测定。 例如，胶原蛋白-纤维蛋白凝胶用于在 3D 环境中生长癌细胞，以确定杀死所有癌细胞所需的 T 细胞的JD浓度（Budhu，2010）。最近，微流体球体培养用于免疫检查点封锁的体外分析（Jenkins，2018）。 尽管这些模型在模仿体内环境的某些方面显示出希望，但它们通常通量低或无法考虑细胞外基质（ECM）在肿瘤生物学中的关键作用。

      生物打印是一项新兴技术，使研究人员能够自动化制造肿瘤构建体以筛选抗ai药或免疫刺激剂。该技术沉积了一种充满细胞的 ECM 材料（通常称为生物墨水），与肿瘤细胞混合，随后进行化学或热固化，从而为打印结构提供机械强度。在这里，我们探索了3D T 细胞细胞毒性测定法的生物打印技术的潜力，以帮助评估免疫检查点YZ剂。

材料和方法

细胞准备

为该项目选择了小鼠肺癌细胞系（LLC-1）和同型 OT-1T 细胞。两种细胞类型均在C57BL/6 背景中。 Lewis 肺癌细胞（LLC-1）从美国典型培养物保藏ZX（ATCC）获得，并根据建议的方案进行培养，每 3 至 4 天传代一次。 为了促进活肿瘤细胞的成像，将编码红色荧光蛋白（RFP）的质粒引入 LLC-1 细胞，以生成稳定的 LLC-RFP 细胞。LLC-RFP 细胞（此后称为“LLC-1”）用于其余实验。按照先前发布的方案（Nath，2016 年），使用 0.75µg / mL SIINFEKL（Ova）肽（New England Peptide）培养 OT-1 脾细胞并将其灌注 5 天。 在第 5 天的共培养研究中，未经进一步纯化就使用了引发的细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）。

生物墨水的制备和生物打印

中和胶原蛋白 I（CELLINK），并与每毫升胶原蛋白中的 106LLC-1 细胞混合。将所有组件（包括注射器，针头和针尖）置于冰上，直至准备使用。将温度控制的打印头（TCPH）设置为 8°C，而将打印床设置为 10°C。使用 BIO X（软件版本 1.8）上的液滴功能在 96 孔板（n= 3）中对三维 LLC-1 肿瘤进行生物打印（见图 1）。印刷后，将 96 孔板转移到 37°C 的恒温培养箱中 20 分钟，以使胶原蛋白聚合。接下来，将 200 µL DMEM 培养基添加到每个孔中。 媒体每 3 天刷新一次。 肿瘤生长 5 天，然后与 T 细胞共培养。

图 1. 肿瘤的三维（3D）生物打印。 使用 BIO X 的液滴打印功能，用胶原蛋白对 Lewis 肺癌细胞（LLC-1）进行胶原蛋白印刷。将胶原蛋白液滴（肿瘤）热固化并在 DMEM 培养基中保持 5 天，然后再与 T 细胞共培养。

 在第 4 天，将打印的肿瘤与 1 µg/ mL 的 SIINFEKL 肽孵育 24 小时，以使肿瘤细胞表达相关抗原。 在第 5 天， 洗涤打印的肿瘤， 并以不同的效应子与靶标（ E∶T） 比

（0∶5）与 T 细胞共培养 48 小时。对于阳性对照，将肿瘤与依托泊苷或 TNFα孵育以诱导细胞凋亡引起的细胞死亡。 阴性对照孔未接受任何 T 细胞或凋亡诱导剂。对于抗原特异性，少数（n = 8）孔中的肿瘤未用 SIINFEKL ZL，但接受了引发的 T 细胞。为了进行免疫检查点分析， 将引发的 T 细胞用 1μg/mL 的抗 PD-1 抗体（ 克隆RMP1-14，InVivoMab）预处理 1 小时，然后将其加入与肿瘤的共培养物中（n = 8）。保留 IgG 同种型对照用于比较。

影像和统计

如先前所述（Steff，2001；Strebel，2001），RFP 荧光的损失被用作肿瘤细胞死亡的读数。 使用 EVOS Auto 2 荧光显微镜进行成像。 使用 ImageJ 软件（NIH）测量荧光强度，并使用 Graphpad Prism 8 进行图形翻译和制备。通过使用学生的 t 检验在 Prism 中对统计结果进行统计，数据表示为平均值±SEM。

结果与讨论

肿瘤细胞生长和球状体形成

      BIO X 上的液滴功能能够自动将稳定的胶原蛋白肿瘤液滴分配到 96 孔板中。 液滴形状和孔位置的均匀性有助于整个显微镜和分析工作流程。 对打印的肿瘤进行 RFP 荧光成像，并用 Calcein AM 染色以确定细胞活力。 图 2 中显示的结果表明，LLC-1 细胞在第5 天在打印的肿瘤中是可行的。此外，这些细胞被限制在胶原蛋白内，而不是逃逸其结构以在 2D 表面上生长。

图 2. 肿瘤细胞的生长和生存力。 对打印的肿瘤进行 RFP 荧光成像，并用钙黄绿素 AM 染色以确定 T 细胞筛选前第 5 天的细胞活力。

3D 中的 T 细胞细胞毒性测定

T 细胞介导的细胞毒性被定量和定性验证。 当将肿瘤与 T 细胞共培养时，观察到肿瘤细胞活力的 T 细胞浓度依赖性降低（见图 3A）。 在 5：1（E：T）的比率（代表 106 CTL/孔）下，与无 CTL 对照相比，观察到了肿瘤生存力的统计学显着降低（p=0.0003）（〜30％）。 在存在或不存在 T 细胞的情况下，打印肿瘤的代表性图像显示在图 3B中，当在共培养物中存在 T 细胞时，RFP 荧光显示出质的下降。T 细胞能够附着在胶原屏障上并在 3D ECM 环境中与癌细胞相互作用。

图 3. 在第 5 天使用 3D 生物打印的肿瘤模型进行 T 细胞细胞毒性测定。（A）观察到 T 细胞浓度依赖性地降低了肿瘤细胞的活力，这是通过 RFP 荧光的丧失来确定的。 CTL 的数量代表每孔的总 CTL。 （B）显示了在存在或不存在 T 细胞的情况下打印的肿瘤的代表性图像。 使用相同的采集参数拍摄图像。

免疫检查点测定

为了扩大 T 细胞杀伤的效用或限制，将肿瘤与经抗 PD1 抗体预处理的初免 T 细胞以 5：1 的 E：T 比例共培养。如图 4 所示，与同种型对照相比，使用抗 PD1 抗体阻断 PD-1 / PD-L1 轴显示出 T 细胞介导的肿瘤细胞杀伤的增加（p＝0.0039）。 因此，由于 PD-1 检查点的阻滞，引发的 T 细胞能够更有效地附着在胶原蛋白屏障上， 更有效地浸润和杀死肿瘤细胞。

图 4. 免疫检查 （A）显示了免疫检查点阻断测定的示意图。 单克隆抗 PD1 抗体阻断了 PD1 与 PD-L1 之间的相互作用，从而增强了 T 细胞对肿瘤细胞的杀伤力。（B）在 IgG 同种型对照或抗 PD1 抗体存在下，将 3D 生物打印的肿瘤细胞与初免化的 T 细胞以 5：1 的 E：T 比例共培养。 PD1 阻断显示出对靶细胞的增强杀伤作用。

结论

v 3D 生物打印技术可用于 T 细胞细胞毒性测定中，以用胶原蛋白打印 RFP 标记的鼠类肺癌细胞。

v 生物打印的肿瘤细胞在胶原蛋白基质内仍然被限制和存活。 观察到 T 细胞浓度依赖性的细胞毒性增加。

v 如文献所述，抗 PD-1 抗体的使用增强了 T 细胞介导的杀伤效率。

v T 细胞细胞毒性测定与高含量成像工作流程兼容，还可以适应其他肿瘤模型，包括患者来源的异种移植，以加快药物筛选过程并推动个性化药物的临床转化。

v 进一步的研究可能包括通过生物打印的肿瘤细胞对抗原呈递的定量，肿瘤中 T 细胞的浸润以及 T 细胞表达的细胞因子。

v 此外，BIO X 上的多孔生物打印格式可用于扩大对生物试剂（例如免疫检查点YZ剂）和工程 T 细胞（CAR-T）的高通量筛选的支持。

参考文献

1. Budhu, S., Loike, J. D., Pandolfi, A. CD8+ T cell concentration determines their efficiency in killing cognate antigen-expressing syngeneic mammalian cells in vitro and in mouse tissues. Journal of Experimental Medicine. 2010; 207(1): 223–235. DOI: 10.1084/jem.20091279.

2. Golstein, P. and Griffiths, G. M. An early history of T cell-mediated cytotoxicity. Nature Reviews Immunology. 2018; 18(8): 527–535. DOI: 10.1038/s41577-018-0009-3.

3. Jenkins, R. W., Aref, A. R., Lizotte, P. H., et al. Ex vivo profiling of PD-1 blockade using organotypic tumor spheroids. Cancer Discovery. 2018; 8(2): 196–215. DOI: 10.1158/2159-8290.CD-17-0833.

4. Nath, S., Christian, L., Tan, S. Y., et al. Dynein seperately partners with NDE1 and dynactin to orchestrate T cell focused secretion. Journal of Immunology. 2016; 197(6): 2090–2101. DOI:10.4049/jimmunol.1600180.

5. Sharon, E., Streicher, H., Goncalves, P., and Chen, H. X. Immune checkpoint inhibitors in clinical trials. Chinese Journal of Cancer. 2014; 33(9): 434–444. DOI: 10.5732/cjc.014.10122.

6. Steff, A.-M., Fortin, M., Arguin, C., and Hugo, P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high-throughput screening technologies. Cytometry. 2001; 45(4): 237–243. DOI: 10.1002/1097-0320(20011201)45:4<237::AIDCYTO10024>3.0.CO;2-J.

7. Strebel, A., Harr, T., Bachmann, F., et al. Green fluorescent protein as a novel tool to measure apoptosis and necrosis. Cytometry. 2001; 43(2): 126–133. DOI: 10.1002/1097-0320(20010201)43:2<126::AID

CYTO1027>3.0.CO;2-J.

8. Topalian, S., Taube, J., Anders, R. et al. Mechanism-driven biomarkers to guide immune checkpoint blockade in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 2016; 16(5): 275–287. DOI: 10.1038/nrc.2016.36.

2019年，3D打印产业规模达到119.56亿美元，年增长率为29.9%；ZG2019年3D打印产业规模为157.47亿元人民币，年增长率为31.1%。

自2011年以来，3D打印产业一直保持持续高速增长态势，离不开各国政府对3D打印产业的QL支持。以我国为例，3D打印被列入了863科技计划、《ZG制造2025》等国家战略，仅在2017年，我国就出台了8项对3D打印的支持政策。在《增材制造（3D打印）产业发展行动计划（2017-2020年）》中明确规定，年均增速达到30%以上，2020年增材制造产业销售收入超过200亿元人民币。由此可见， 3D打印对未来工业的重要性不言而喻。

2020年亚洲3D打印、增材制造展览会（TCT Asia 2020）现场盛况

（视频源自：TCT亚洲视角）

一、什么是3D打印

3D打印又称为增材制造，是20世纪80年代末期兴起的一种快速成型技术，它是以数字模型文件为基础，将粉末状金属或塑料等可粘合材料逐层堆积制造出实体物品的新兴制造技术，对传统的工艺流程、生产线、工厂模式、产业链组合产生深刻影响，是制造业具有颠覆性的成型技术。

与传统的制造技术相比，3D打印不需要预先制造模具，在制造过程中不需要去除大量的材料，也不需要通过复杂的锻造过程就能获得ZZ产品。因此，在生产中可以实现结构优化、节约材料和降低能耗。3D打印技术适用于新产品开发、快速单件和小批量零件制造、复杂形状零件制造、模具设计和制造以及难加工材料制造、形状设计检验、装配检验和快速逆向工程。因此，3D打印行业越来越受到国内外的重视，并将成为下一个具有广阔发展前景的朝阳产业。

二、3D打印发展历程

1986年，美国科学家Charles Hull开发了首台商业3D印刷机。

1993年，麻省理工学院获3D印刷技术ZL。

1995年，美国ZCorp公司从麻省理工学院获得授权并开始开发3D打印机。

2005年，市场上高清晰彩色3D打印机Spectrum Z510由ZCorp公司研制成功。

2010年11月，美国Jim Kor团队打造出世界上DY辆由3D打印机打印而成的汽车Urbee问世。

2011年6月6日，发布了DY款3D打印的比基尼。

2011年7月，英国研究人员开发出世界上DY台3D巧克力打印机。

2011年8月，南安普敦大学的工程师们开发出世界上DY架3D打印的飞机。

2012年11月，苏格兰科学家利用人体细胞首次用3D打印机打印出人造肝脏组织。

2013年10月，首次成功拍卖一款名为“ONO之神”的3D打印艺术品。

“ONO之神”（图片源于：雅昌艺术网）

2018年12月10日，俄罗斯宇航员利用国际空间站上的3D生物打印机，设法在零重力下打印出了实验鼠的甲状腺。

2019年1月14日，美国加州大学圣迭戈分校首次利用快速3D打印技术，制造出模仿神经系统结构的脊髓支架。

2019年4月15日，以色列特拉维夫大学研究人员以病人自身的组织为原材料，3D打印出首颗拥有细胞、血管、心室和心房的“完整”心脏。

2019年10月13日，河北工业大学用3D打印技术成功在校区内复制并装配了具有1400多年历史的赵州桥，为古迹修复做出了有益尝试。

2020年5月5日，ZG长征五号B运载火箭上搭载的“3D打印机”，在太空中开展连续纤维增强复合材料的3D打印实验。这是人类首次实现太空3D打印实验。

长征五号B运载火箭

三、3D打印主要国家市场份额

3D打印主要集中在美、德、中、日、英等几个国家，2019年市场份额分布图如下：

四、3D打印产业结构

3D打印产业主要包括3D打印材料、3D打印设备及3D打印服务三个方面。在2019年3D打印产业规模中，三者占比分别为24.1%、44.3%和31.6%。

3D打印材料是3d打印技术发展的重要物质基础。在某种程度上，材料的发展决定了3D打印能否得到更广泛的应用。

目前，3D打印材料主要包括工程塑料、光敏树脂、橡胶材料、金属材料、陶瓷材料、彩色石膏材料、人工骨粉、细胞生物材料、砂糖等，随着技术的发展和进步，材料的种类还会越来越丰富。

3D打印作为一种新兴的制造技术，目前，国内尚未制订出3D打印材料标准、工艺规范、零件性能标准等行业标准或国标，但对于粉末类3D打印材料，业内已经形成了一些评价指标，主要有化学成分、粒度分布、粉末球形度、流动性、松装密度等，其中，化学成分和粒度分布是最常用的两个评价指标。欧美克Topsizer Plus激光粒度分析仪

对于不同的3D打印技术，对于粉末材料的粒度分布要求也不同，比如，以激光作为能量源的打印机，因其聚焦光斑精细，较易熔化细粉，适合使用15~53μm或5~25μm的粉末作为耗材，因为此粒度范围内的粉末既有良好的流动性，又较易熔化；以等离子束作为能量源的打印机，聚焦光斑略粗，更适于熔化粗粉，适合使用53~105μm的粉末作为耗材。

3D打印行业普遍采用欧美克激光粒度分析仪测试粉体材料的粒径分布，欧美克激光粒度分析仪具有动态测试范围宽及测试结果真实性、重复性、再现性、分辨力和灵敏度高等特点，是3D打印材料理想的粒径分布测试仪器。

背景

牙周炎是一种较为常见的慢性炎症，常发生于30岁以上的成年人。若不进行及时有效的治 疗，将可能导致严重的牙周损坏，包括牙槽骨、牙周韧带、牙骨质等，并导致牙齿脱落。针对该疾病，目前主流的治 疗方法较多，包括龈下刮治术、根面平整术、翻瓣术等手术方式，也有通过降解膜引导的组织再生法。

  因组织的成分复杂性和牙周缺陷的结构复杂性，组织再生法一直没有显著突破。最近，Arwa Daghrery等科研工作者尝试使用生物3D打印的方式，通过静电纺丝书写这一功能构建支架，促进牙周组织再生。其创新点主要有以下两个：一、验证模拟天然组织的结构和组成可促进组织有效整合这一理论；二、考虑体内免疫应答在组织再生中的作用，调整支架成分。

实验细节及结果

作者使用的主体材料为PCL——一种FDA批准可用于人体的聚合物，可在加热条件下熔融，并可在电场下被拉成极细的纤维，因此可以应用于静电纺丝书写中。使用的设备为放置于生物安全柜中的regenHU生物3D打印机（配备MEW：熔融静电纺丝书写打印头）。将原料颗粒置于料仓中，加热至90℃并维持30 min后，以一定的气压、电压和速度进行打印。

文中提到的实验主要分为两部分：

一、体外实验：考察不同打印条件所得支架的细胞增值情况。作者分别打印出随机（Random）、有序（Aligned）、小孔（Small Spacing，250 μm间距）、大孔（Large Spacing，500 μm间距）四种支架结构（图1），在附着细胞并培养1、3、7天后，分别对细胞成活率进行检测。结果为有序（Aligned）打印模式下的支架效果更好（图2）。

图1 四种打印支架的结构电镜图

图2 培养细胞后的支架分别于1、3、7日获得的细胞成活率

二、体内实验：在大鼠牙槽构建模型，验证模拟天然组织的结构和组成可促进组织有效整合这一理论，阐明纤维形态学、纤维间距、化学组成对牙周组织再生的影响。在这一环节，作者选用的支架纤维形态学为有序（Aligned），因其在之前的结果中效果更佳；而纤维间距尽管在上一环节表现不尽人意，但为了促进组织再生（提供更大的空间以便于细胞增殖），作者参考了其他文献，选用了500 μm的间距；化学组成则为该课题组之前的研究成果，在普通PCL上覆盖氟化磷酸钙（Fluorinated calcium phosphate，F/CaP）使牙槽骨再生更加稳固以支撑牙周韧带的生成；同时，为了防止软组织渗透进入创伤部分阻碍牙周再生，作者也添加了胶原（Collagen）提供临时屏障，抵挡牙龈上皮细胞和纤维原细胞的侵入。因此在对比实验中，共有4组，分别为对照组（Sham）、胶原组（Collagen）、覆盖氟化磷酸钙的有序骨架组（Aligned+F/CaP）、在空隙填充胶原的覆盖氟化磷酸钙有序骨架组（Aligned+F/CaP_COL）。

在植入大鼠牙槽后分别于第3、6周检测骨体积（BV）和骨填充比例（BF），发现Aligned+F/CaP_COL的表现更佳（图3）。

图3 骨体积（BV）和骨填充比例（BF）对比

小结

作者的成果为牙周组织再生提供了新的治 疗思路，但目前仍停留在小型动物实验阶段。未来如果能成功进行大型动物甚至人体实验，将大大提升这一方法的可行性。

参考文献

[1] Arwa D, Jessica A. F, Jinping X, et al. Tissue-specific melt electrowritten polymeric scaffolds for coordinated regeneration of soft and hard periodontal tissues[J]. Bioactive Materials 19 (2023) 268–281.

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往期回顾：

● 生物3D打印应用 | 挤出与静电纺丝配合打印三维活性生物结构

● 生物3D打印的原理与实验方案（一）：生物墨水及新兴研究方向

● 生物3D打印应用 | 电极心肌贴片

● 生物3D打印应用 | 缓释复合成分药片

摘要

基于细胞的体外预测模型可能支持国际上开发新疫苗和其他治疗肺相关疾病（如 COVID-19、慢性阻塞性肺病或特发性肺纤维化）的努力。将3D生物制造与气液界面培养相结合，可以对组织模型进行工程改造，从而在体外重现健康和患病状态下呼吸道的典型特征。这些模型不仅提供了深入了解病毒与靶位点宿主细胞相互作用的潜在机制的机会，而且还有助于减少未来研究中使用的动物数 量，从而支持 3Rs（替换、减少和细化）原则。在这项研究中，我们描述了 3D 生物制造气道上皮模型的生成及其生理相关性的评估。该模型的特点是血管紧张素转换酶 2(ACE2) 的表达，ACE2 是冠状病毒内化所需的一种蛋白质。 ACE2蛋白定位于顶膜表明上皮细胞是极化的，粘蛋白5AC蛋白的存在表明该模型可以产生气道表面液体，这是气道上皮细胞的一种生理功能。因此，这些生物工程组织模型可用于开发不同的疗法和疫苗。

介绍

2019年底出现的新型冠状病毒病（COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的。 该病毒具有高度传播性，并使用血管紧张素转换酶 2 (ACE2) 作为主要受体进入哺乳动物细胞。ACE2 是一种细胞表面蛋白，存在于许多细胞和组织中，包括肺、心脏、血管、肾脏、肝脏和胃肠道(Hamming, 2004)。 ACE2 在健康肺组织中适度表达，在慢性阻塞性肺病 (COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、哮喘、糖尿病和高血压等病理状况中高度表达 (Saheb Sharif-Askari, 2020)。 众所周知，SARS-CoV-2 会感染呼吸道并传播到整个人体，导致多器官感染症状（de Melo，2021 年）。 因此，由于病毒对人类健康的严重影响，开发新的诊断方法、疫苗和抗病du药物迫在眉睫。

图 1. (A) 使用 CAMotics 的 3D 生物打印模型图示，俯视图（左）和侧视图（右）。 (B) 3D 生物打印肺组织模型转移到 Transwell 插入物。

体外模型对于了解疾病机制以及在临床试验前验证治疗方法至关重要。 尽管目前的 2D 培养模型在筛选病毒复制、感染和药物筛选方面很常见，但它们无法概括组织的复杂性和生理学。 然而，像 3D 生物打印技术这样的新平台可以生成在分子组成、生物力学和复杂性方面更类似于原位组织的组织模型（Singh，2020；Seyfoori，2021）。 这些 3D 生物打印模型可以更好地了解类似于人体器官的微环境中潜在的宿主-病原体相互作用，从而有助于筛选针对肺部疾病（如COVID-19）的药物。

在这项研究中，我们专注于生物打印原代人支气管上皮细胞或 Calu-3 细胞以生成气液界面 (ALI) 模型。Calu-3 是一种分化良好且具有特征的细胞系，来源于人支气管黏膜下腺 (Zhu, 2010)。 人肺的黏膜下腺是气道表面液体、粘蛋白和其他免疫活性物质的主要来源。

生物打印的肺病模型在 Transwell 插入物中培养 14 天，并对 ACE2 和粘蛋白 5AC (MUC5AC) 蛋白进行免疫染色。 使用本应用说明中介绍的实验装置，可以研究宿主-病原体与 SARS-CoV-2 和气道上皮细胞的相互作用（Zhu，2010）。

图 2. 第 7 天 (D7) 和第 14 天 (D14) 肺组织模型在 10 倍放大时的 H&E 染色。 位于构建体顶部的 Calu-3 和 HBE 细胞的上皮层。 比例尺=100 µm。

材料和模型

细胞准备

在肺组织模型中使用了两种不同的上皮细胞类型：人支气管上皮细胞（HBEpC；C-12640，PromoCell）和 Calu- 3（肺腺癌细胞衍生的上皮细胞；HBT-55，ATCC）。人肺成纤维细胞（HPF；C-12360，PromoCell）用作支持细胞。 在根据各自制造商的协议进行生物打印之前，将细胞解冻并在 2D 中扩增。 HBEpC在气道上皮细胞生长培养基（C-21060，PromoCell）中培养，HPF在补充有生长培养基2试剂盒（C-23020，PromoCell）的成纤维细胞生长培养基2中培养，分别用于第4代和第9代； 而 Calu-3 细胞在补充有 10% 胎牛血清 (FBS; 10270106, Gibco Thermo Fisher Scientific) 和 1% 青霉素-链霉素-新霉素混合物 (PSN; 15640055，Gibco Thermo Fisher Scientific）并用于第 4 段。

肺组织模型的生物打印

肺模型被设计成一个圆盘，底部有一个实心层，顶部有一个 5 层边缘（图 1A、1B）。 这样做是为了促进接种后上皮细胞的包埋。 该磁盘是用 GelMA-Laminin 521 (GelMA-LN521, CELLINK) 3D 打印的。 接下来，将 2 x 106 HPF 用胰蛋白酶消化、洗涤、收集、旋转并轻轻重悬于 100 µL 成纤维细胞培养基 2 中，然后将其小心地混合到1mLGelMA-LN521生物墨水中，预热至37°C并转移到琥珀色墨盒中（ CSO010311502，CELLINK）。 为了去除截留的气泡，将嵌入 HPF 的 GelMA-LN521 滤芯以 460g 离心 1 分钟。 在开始打印会话之前，将墨盒安装在 BIO X™ 生物打印机中设置为 27°C 的温控打印头（00000020346，CELLINK）中 20 分钟。 将药筒倒置 2 至 3 次以避免细胞沉淀。 GelMA-LN521 生物墨水的合适生物打印温度为 26°C 至 27°C。然后在 12 孔板中使用温控打印头在 27°C 下对圆盘篮进行生物打印。 首先使用 405 nm 光固化模块（距离设置为 5 厘米）对每个构建体光固化 12 个圆盘复制品，并将成纤维细胞生长培养基添加到每个孔中。 然后在添加上皮层之前，将圆片在成纤维细胞生长培养基中于 37°C 孵育 3 天。

图 3. HBE 细胞中 ACE2 的免疫染色。 在 ALI 培养的构建体上不同天的 ACE2（绿色）和细胞核染色 DAPI（蓝色）。 比例尺=100 µm。

增加肺上皮层

对于上皮层，将 HBE 或 Calu-3 细胞分别重悬于气道上皮生长培养基或 MEM 完全培养基中，并补 3充 5 ug/mL LN521。将 150K 细胞/cm2 接种在每个圆盘的顶部。从孔中取出成纤维细胞培养基，将5 x 105 个细胞重新悬浮在 360 μL 的完全培养基中，并在每个圆盘的顶部添加 30 μL 的细胞悬浮混合物。接种后将构建体留在工作台上 10 分钟，然后转移到培养箱中再放置 20 分钟以使细胞附着在生物打印盘上。将 HBE 构建体以 1:9 的比例轻轻浸入成纤维细胞和气道上皮培养基的混合物中；将 Calu-3 构建体以 1:9 的比例浸入成纤维细胞和 MEM 培养基的混合物中。浸没培养物在37°C、5% CO2 下生长 4 天，然后转移至 ALI 培养物。 ALI 培养是通过将结构转移到 Transwell 插入物中来建立的，该插入物补充了适当体积的相同介质，如上所述（图 1B）。培养基每 2 至 3 天更新一次。

图 4. Calu-3 细胞中 ACE2 的免疫染色。 细胞在 ALI 培养物中的 GelMA-LN521 上生长。 在第 7 天 (D7) 和第 14 天 (D14)，对细胞进行固定、切片和 ACE2 染色（绿色）。 使用 DAPI（蓝色）可视化细胞核。 构建体在明场中可视化以查看 ALI。 比例尺 = 100 µm。

分析

根据 CELLINK 的固定方案，在第 7 天和第 14 天（ALI 培养）收集样本，并在 4% 多聚甲醛 (PFA) 中固定进行组织学染色。 然后将样品包埋在石蜡中，按照 CELLINK 的切片协议，使用切片机获得10 µm 切片。 按照 CELLINK 的免疫荧光方案并使用 Alexa Fluor 488（A-11029，Thermo Fisher Scientific）作为二抗，对切片进行 ACE2（MAB933，R&D Systems）和 MUC5AC（AB3649，Abcam）染色。 样品也按照 CELLINK 的方案进行了 H&E 染色。 所有协议都可以在 CELLINK 网站的 Support 选项卡下找到。

图 5. HBE 细胞中粘蛋白的免疫染色。 细胞在 ALI 培养物中的 GelMA-LN521 上生长。 在第 7 天 (D7) 和第 14 天(D14)，细胞被固定、切片并染色 MUC5AC（红色）。 使用 DAPI（蓝色）可视化细胞核。 构建体在明场中可视化以查看ALI。 比例尺 = 100 µm。

结果与讨论

用于生成肺组织模型的制造方法创建了一个完整且坚固的构造，在整个实验过程中保持其形状。 样品横截面的H&E 染色显示，接种在构建体顶部的 Calu-3 和 HBE 细胞在第 7 天形成了紧密的单层。然而，在第 14天，Calu-3 细胞形成了厚的多层上皮样 结构，而 HBE 细胞仍然保持薄的单层（图 2）。 这表明初级支气管上皮细胞保持了接触抑制，这种抑制在癌细胞中丢失，导致细胞相互重叠生长。

图 6. Calu-3 细胞中粘蛋白的免疫染色。 细胞在 ALI 培养物中的 GelMA-LN521 上生长。 在第 7 天 (D7) 和第 14 天 (D14)，细胞被固定、切片并染色 MUC5AC（红色）。 使用 DAPI（蓝色）可视化细胞核。 构建体在明场中可视化以查看 ALI。 比例尺 = 100 µm。

接下来，我们对 ACE2 进行了免疫染色，ACE2 是一种参与冠状病毒内化的细胞表面蛋白。在 HBE 样本中，在第 7 天单层中很少有细胞对 ACE2 进行染色，而在第 14 天，在许多细胞中检测到 ACE2 染色（图 3）。与HBE 不同，Calu-3 样本中的大多数细胞在第 7 天和第 14 天都对 ACE2 进行了染色（图 4）。此外，在顶端膜域（ALI 培养中的空气表面）观察到 ACE2 的免疫染色，如在第 14 天样品中朝向顶部 Calu-3 细胞的局部绿色信号所见（图 4），表明细胞层是极化的。这些数据一起表明，我们的 Transwell 模型显示了极化的气道上皮细胞，在原代细胞和癌症衍生细胞中都表达了 ACE2。

为了进一步表征模型，我们对 ALI 培养结构中的粘蛋白进行了免疫染色，因为据报道 MUC5AC 是由气管支气管表面上皮中的杯状细胞产生的 (Kesimer, 2009)。我们在 ALI 培养模型中观察到 MUC5AC 在 HBE 和 Calu- 3 细胞中的表达（图 5、6），表明细胞已经分化。我们的数据共同表明，这里介绍的 3D 生物制造模型将为设计 3D 肺组织模型提供一个极好的工具，以快速筛选针对 COVID-19 的生物制剂。这也将有助于减少动物研究，从而支持 3R 原则。

结论

该研究表明，3D 生物打印与 Transwell 细胞培养相结合可用于生成复杂的体外肺上皮模型。

* 体外 ALI 模型显示 ACE2 和 MUC5AC 蛋白的表达。

* 原代支气管上皮细胞在整个实验过程中保持紧密的单层，而 Calu-3 细胞在第 14 天形成多层上皮。

* 与腺癌细胞来源的 Calu-3 细胞系相比，ACE2 在原发性支气管上皮细胞中的表达中等。

* ALI 培养中生长的细胞变得极化，如培养物顶膜上 ACE2 的表达所见。

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BioNTech/Pfizer和Moderna的疫苗主要由核酸脂质纳米粒(LNPs)包裹的mRNA组成。纳米药物递送平台的模块化和产业化并非短时间内完成的，而是数十年来密集研究的产物，在设计合适的mRNA-LNPs疫苗时，需要考虑诸多因素。本文作者简要概述了mRNA-LNPs疫苗递送系统仍须考虑的关键问题，接着，对3D生物打印组织上的疫苗验证提出了自己的看法。与动物模型相比，3D生物打印验证系统在未来会承担更快、更低成本、更有预测性的疫苗测试任务。

LNPs的疫苗递送系统仍须考虑的关键问题：

1.脂质成分替代

大多数情况下，治疗靶点决定给药途径的选择，Onpattro®的脂质成分专门设计用于静脉给药后的肝细胞靶向，其中，阳离子脂质作用于siRNA的包裹与释放，PEG脂质有助于增加药物的血液循环时间。然而，这两种脂质成分也都有各自的缺点。例如，阳离子脂质易受温度和pH依赖性水解的影响，导致纳米粒子的不稳定，而高浓度的PEG脂质会阻止RNA进入细胞，其引发的PEG免疫反应也会加速血液清除现象。

图1.各脂质成分及LNP示意图

对于mRNA-LNPs疫苗，肌肉注射是最常见的给药途径，这允许LNPs扩散到淋巴,在淋巴中，mRNA-LNPs疫苗可以直接接触APCs，不存被免疫细胞清除的风险，这意味着通过肌肉给药时，LNPs中的阳离子脂质和PEG脂质为非必须成分。因此，未来的研究旨在发掘阳离子脂质和PEG脂质的替代材料，以获取更好的疫苗效果，如可对两性离子材料和人工蛋白涂层等进行研究。

2.mRNA-LNPs真实结构探究

纳米尺度的结构排列是决定核酸功能传递的关键因素，不同形态的纳米粒子其转染性能差异巨大。到目前为止，对于LNPs中包裹mRNA的确切排列还没有较为透彻的研究，大部分的信息都是通过siRNA-LNPs系统获得的。然而，mRNA至少比siRNA大100倍，从siRNA-LNPs的结构中获得的经验是否以及在多大程度上适用于mRNA-LNPs仍存在争议。

图2.LNP不同结构排列示意图

如能更好地理解纳米粒子结构与活性之间的关系，则可更快速的优化mRNA-LNPs并创建有效的免疫传递系统。在这方面，定量结构-活性关系(QSAR)方法可以用于预测mRNA-LNPs的合成特性与其在细胞水平上的作用机制之间的关系。QSAR方法假设具有相似合成特性的LNPs将与细胞发生类似的相互作用，从而引发类似的生理反应(例如，蛋白的表达和抗体的产生)。作者预计QSAR研究将使体外生物活性预测成为可能，并加速mRNA-LNPs疫苗的优化过程。

3D生物打印组织上的疫苗验证

给药系统的验证需要建立适当的体外模型进行配方筛选。虽然二维细胞培养系统在药理研究方面发挥着关键作用，但其缺乏由相邻细胞、分子梯度和细胞外基质(ECM)等组成的复杂组织结构，所得的研究结果很难转化至体内生理系统。3D生物打印则能创建更接近生理环境的立体模型，使用3D细胞培养也有利于通过多种荧光标记或其他旨在跟踪免疫细胞之间相互作用的技术来跟踪细胞与细胞之间的动态相互作用。

图3.在3D生物打印组织中进行LNPs特异性递送试验

近些年来，仿生3D组织模型的开发取得了诸多进展，肺部组织的3D模型已用于器官功能衰竭的研究、完整的具有免疫能力的3D皮肤也已用于疫苗反应分析。在减少试验动物数量的同时，3D组织模型还能帮助人们从根本上了解免疫激活效力与给药途径不同带来的差异，这在疫情大流行的背景下显得非常有必要。

小结

在应对疫情方面，mRNA-LNPs疫苗已取得了很好的成绩，但仍有较大的改进空间。不断的优化载体成分与配比，摸清LNPs纳米尺度的排布规律，方能积累更多的可用经验，为LNPs其他领域的治疗提供新动力。而3D生物打印则为疫苗的测试提供了全新的路径，相信在未来几年，3D生物打印定能提供更快、更有预测性的疫苗测试能力。

注：文章内容多来自文献参考，文献题为“Principles for optimization and validation of mRNA lipid nanoparticle vaccines against COVID-19 using 3D bioprinting”，如需了解更多内容，可直接查阅原文献。

参考文献：

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