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荧光定量PCR试剂本生(天津)健康科技有限公司供应：移液器吸嘴，离心管，冻存管，培养皿全系荧光定量PCR耗材，产品包括：PCR单管、PCR八联管、96孔板、384孔板。

荧光定量PCR试剂

产品优势：本生生物代理实验室R耗材品种全，可替代仪器原厂耗材，性价比高，质量稳定，对用户可以节省实验成本。

适应客户：医院检验科PCR实验室，验室；第三方检测机构，科研院所，大专院校，制药厂，试剂生产厂家，疾控，检验检疫。

来自美国Azure Biosystems公司的Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统，融合了高品质Pilter温度模块和基于光纤传输的光学检测系统，为您的科学研究提供高jing准、高灵敏的可靠结果。北京深蓝云生物科技有限公司已经为您准备好了仪器，期待您的SY哦~

既然仪器已经备好了，那么该怎样选择检测方法呢？

众所周知，qPCR依托于荧光检测技术，通过使用DNA结合染料、荧光PCR引物或探针等实时监测目的基因的扩增，从而对目的基因进行定量分析。为了避免在实验时出差错，下面就跟着小编一起来看一下常用的经典方法吧~

1、 DNA结合染料—SYBR Green I 法

•  原理：SYBR Green I 是一种DNA结合染料，其与双链DNA结合后，荧光大大增强，DNA与染料结合所释放的荧光量与dsDNA的数量成正比。因此，检测到的荧光信号可反映出PCR体系存在的双链DNA数量。

•  特征：可逆荧光，Z大吸收波长497nm，Z大发射波长520nm。

•  适用情况：非特异性的荧光染料，不能识别特定的双链，只要是双链（包括非特异性扩增产物、引物二聚体等）就会结合发光，在临床上使用可能会有假阳性发生。但该方法容易建立实验体系，可进行熔点分析，通用性好，价格相对较低，在科研中使用比较普遍。

2 、TaqMan 探针法

•  原理：检测时除了需要一对特异性引物外，还需要一条与靶序列互补配对的寡核苷酸链—TaqMan探针，其5’末端包含荧光报告基团R，3’末端为淬灭基团Q。当探针与靶序列互补配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5’核酸外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。荧光信号和产物的量相匹配。

•  特征：检测到的是积累荧光，随着循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。

•  适用情况：特异性较强，可进行多重qPCR分析，但成本较染料法要高一些，实验构建相对复杂。常用的荧光基团推荐：FAM、VIC、HEX、CY5等。

3 、分子信标(molecular beacon)

•  原理：分子信标方法在检测时除了需要一对引物以外，还需要一条呈发夹结构的寡核苷酸探针（25-40nt），分子信标的 5'端附有荧光报告基团，3'端附有淬灭基团，环被设计成与靶序列互补的15–30核苷酸，其两端各有5-7个核苷酸互补形成茎结构，将报告基团与淬灭基团连接到一起。发夹结构中，由于报告基团接近淬灭基团，监测不到荧光信号，当环的部分与核酸序列互补配对，分子信标打开成链状，使得荧光基团与淬灭剂分开，发射荧光。

•  特征：茎环结构，也是积累荧光。

•  适用情况：高特异性、可以用于多重反应，适合区分等位基因。但不能做熔点分析；发夹的茎结合过强过弱都不合适，过强的话，信标不能与靶标正确杂交，过弱的话，会随机折叠成非发夹结构，导致产生杂信号。常用的荧光基团有FAM 、Texas Red等。

4  、荧光共振能量传递(FRET)

•  原理：FRET探针又称双杂交探针，由两条相邻探针组成。一个探针3'端带有供体基团，第二个探针的5'端带有受体基团，在PCR反应的退火步骤，两条探针头尾相连地分别杂交在靶标序列上，荧光分子接近，从供体到受体产生荧光共振能量传递，受体荧光信号的增加与扩增子出现的量成比例。

•  特征：由于FRET探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，而非积累荧光。

•  适用情况：除引物外需要设计两条探针，通用性不高；需挑选合适的供体及受体基团，供体基团发射波长与受体基团的激发波长需显著重叠，而供体基团发射波长与受体基团的发射波长要明显分离。可做熔点分析，特异性较强。

5 、 LUX Primers

•  原理：LUX (light upon extention) 引物是通过荧光标记的引物，使引物可以实现探针的功能。其原理和分子信标类似，LUX引物也是发夹结构，其中一条引物3’端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生荧光信号。

•  特征：积累荧光；不需要额外设计探针。

•  适用情况：不能进行熔点分析，通用性比不上SYBR Green I。但不需要专门设计探针，同时不会受非特异性扩增产物和引物二聚体的影响，特异性较SYBR Green I强。

【以上内容来源于网络整理，侵删】

看完了上面关于经典qPCR检测方法的介绍，您是不是有想去跑一轮qPCR的冲动呢？

美国Azure Biosystems公司的Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统，提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根据实验需求灵活配置。

☑   数据可靠性: 连续1000次实验后，结果高度一致，温控jing准，性能稳定可靠。

☑  应用灵活性: 提供多种qPCR应用分析，定制化报告。

☑   流程智能化: 中英文用户界面，触控操作，可多机联用。

☑   交互灵活性: 主机可独立运行qPCR程序，电脑、Wi-Fi、网络交互。

我们都知道在实时定量PCR（qPCR）中，可以通过Cq值和标准曲线得出样本的初始拷贝数。但Cq值与样品中靶标的拷贝数有关，也会受到PCR反应的效率和仪器检测灵敏度的影响。高灵敏度的仪器可以减少检测样品所需的循环数，节省时间并提高效率；同时也可以减少假阴性的存在。Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的设计初衷，就是为了高灵敏高性能而生，每个孔配有单独的激发和发射光纤，可有效提高灵敏度并降低背景噪声干扰（图1左）。此外跟同类产品相比，Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统使用全孔检测技术，每个孔可采集约100,000个数据点，使每个qPCR扩增曲线能够准确、可重复和灵敏地表示荧光强度，从而提高荧光数据的可靠性（图1右）。

▲ 图1. 高性能光路系统

为了进一步表明Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的灵敏度，与同类产品进行了以下比较实验：使用酵母的三个RNA靶标进行检测，分别是高丰度的Actin基因、低丰度的6Y’端粒基因，以及单拷贝的TEL06R端粒基因。

材料和方法

从10mL酵母培养液中制备出RNA，将3µg RNA逆转录成cDNA作为模板备用。对于Actin，在Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统上使用的cDNA按1：20稀释；其他的cDNA均按1：10进行稀释。引物如下：

▲ 表1. Actin、6Y’端粒基因和TEL06R端粒基因的引物对

采用4个4倍系列稀释的cDNA模板和一个无模板对照来计算qPCR扩增效率，反应体系和扩增程序如下：

结果和讨论

在高丰度Actin和低丰度6Y’端粒基因的检测中，Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统和同类产品的扩增效率非常相似（表2）。然而，在单拷贝TEL06R端粒基因的检测中，发现同类产品得到的Cq值偏大，位于35-38之间，导致计算出的扩增效率大于200%，不能作为参考数据；Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统则计算得出E=96%（表2）。

▲ 表2. 各基因的扩增效率及R2值

同时结果表明，尽管Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的Actin cDNA上样量仅为同类产品的一半，但Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的Cq值小于同类产品的Cq值，两者相差0.65（表3）。针对低丰度的6Y’端粒基因和单拷贝的TEL06R端粒基因，两者的Cq值差异较大，差值分别是2.25和4.02（表3）。这些结果表明，随着基因起始拷贝数的减少，Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统灵敏度的提高变得尤为重要。

▲ 表3. 各基因的数据对比

灵敏度也会直接影响数据的准确度和再现性。随着PCR循环数的增加，非特异性产物或引物二聚体扩增的可能性也增加。尤其是使用非特异性荧光染料（如SYBR green）检测PCR产物时，更需要避免过多的循环数。因此，在早期循环中检测扩增的能力大大提高了数据的可靠性。

具有单孔检测的Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统设计用于最小化背景噪声和最大化灵敏度，以实现qPCR反应中特异性和精确度。快快申请试用，让它帮助你优化qPCR实验吧。

介绍：

Azure Cielo™ 3和Cielo™ 6 实时荧光定量PCR系统具有ZY的灵敏度。该系统配置新型的高性能光学系统，采用16组光纤单孔扫描设计，一根光纤用于高能LED激发，另一根用于光信号检测，可16孔同时采集(图1)。特殊的激发/发射方式保证单孔扫描时仅激发一个孔，光纤传导也有效消除光散射，完全避免孔外区域的激发，减少背景噪声的来源，以便更灵敏的检测。

同时Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统采用“全孔检测”技术，每个孔可采集大约100,000个数据点。检测时取读数的平均值，JZ测定每个孔的荧光强度。这种“全孔检测”为每个采集时间点提供了比单孔扫描系统更准确的数据，因为单孔扫描系统仅仅采集少量的数据点。

如何可靠地检测低拷贝数的靶标呢？首先要考虑引物和探针的特异性，这会直接影响qPCR检测能力的高低，其次考虑灵敏度，即当探针信号高于背景噪声时仪器检测的灵敏度。在其他的反应成分相同的情况下，更高灵敏度的仪器可以更早的检测到信号或得到更小的Cq值。为了证明Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统在低拷贝数的靶标检测中的灵敏度和重复性，进行了单拷贝靶标DNA的扩增实验。

方法：

配制20µl反应体系，利用单拷贝DNA为模板进行qPCR扩增。

分别在Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统和竞争产品的系统上运行两次96孔板。使用每个仪器提供的软件收集和分析数据，以确定每个孔的Cq值。

结果与讨论：

单拷贝DNA扩增结果发现，在Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统中检测到88个孔(92%)有荧光信号，竞争产品中检测到77个孔(80%)(图2A)，结果表明，Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统提高了单拷贝扩增的检测概率，这也反映了其检测灵敏度更高。那么对于单拷贝DNA扩增来说，那些没有荧光信号的孔可能是靶标DNA没有进入到孔中，所以没有检测到荧光信号。

同时发现，Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统测量的Cq平均值比竞争产品要早2个循环(Cq 36.39 vs 38.53)(图2A)。并且Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的Cq值SD小于竞争产品的值(0.91 vs 1.16)，这进一步说明了Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的检测具有良好的重复性。

此外，将两者的扩增曲线进行比较，发现在竞争产品上某些扩增曲线起峰较晚，扩增曲线起峰位置不一致（图3B），Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的扩增曲线起峰位置基本一致（图3A）。这也说明了Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统高灵敏度的“全孔检测”技术和多数据点的捕获方式可以给您带来真实可靠的扩增结果。

总的来说，随着靶标DNA数量的减少，qPCR的可靠性也会逐渐降低，然而现代应用不断突破这一技术的极限，对qPCR的性能提出了更高的要求。以上结果证明了Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统具有ZY的灵敏度和可靠性，即使检测单拷贝DNA分子，仍可获得具有高度重复性的定量数据。

参考文献：

1. Lockey C, Otto E, Long Z. Real-Time Fluorescence Detection of a Single DNA Molecule. BioTechniques. 1998; 24:744–746.

2. Stowers CC, Haselton FR, Boczko EM. An Analysis of Quantitative PCR Reliability Through Replicates Using the Ct Method. J Biomed Sci Eng. 2010;3(5):459-469.

3. Stadler J, Eder J, Pratscher B, et al. SNPase-ARMS qPCR: Ultrasensitive Mutation-Based Detection of Cell-Free Tumor DNA in Melanoma Patients. PLoS One. 2015;10(11):e0142273.

4. Tosiano MA, Jacobs JL, Shutt KA, et al. A Simpler and More Sensitive Single-Copy HIV-1 RNA Assay for Quantification of Persistent HIV-1 Viremia in Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy. J Clin Microbiol. 2019;57(3):e01714-e01718.