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       深脑钙成像技术在神经科学领域内的应用愈加广泛，它通过微型荧光显微镜系统，观察行动自由的动物大脑深处的神经元活动，可以更好地揭示内在的神经活动，对于理解动物行为与认知功能背后的神经编码机制变得越来越重要。

       利用微型显微镜，对于基底和外侧杏仁核(BLA)的细胞群如何编码条件刺激和非条件刺激之间关联的研究（参考文献：Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Benjamin F. Grewe et al.,  Nature. 2017）

       然而该显微镜必须与GRIN（Gradient index）Lens相结合，通过将GRIN Lens埋植在目的脑区上方，可以同时捕捉到成百上千个大脑深层区域的神经元的钙活动。在GRIN Lens植入前，需将目的脑区上方的脑组织移除，抽吸是一种广泛采用的方法。然而，典型的脑组织抽吸方法仍依赖于手持式真空针，存在人为误差和重复性差的问题。

       基于文献研究(Barbera et al.,2016; Jung et al., 2004; Pinto and Dan, 2015; Ziv et al., 2013)，强烈建议对中等深度的大脑区域，如前额叶皮层、海马和纹状体等植入1 mm直径GRIN lens的大脑区域，采用缓慢的逐层抽吸的方式进行脑组织抽吸。

       为此，我们为大家提供了一种高精度的脑组织抽吸自动化手术仪器—自动透镜植入定位仪。

       该仪器通过电脑软件精确控制步进电机，进而驱动定位仪操作臂移动，并结合真空泵自动jing准的移除脑组织，以便更好地埋植透镜。

       与传统手动方法相比：它可以大大减少人为误差，缩短实操训练时间，大大提高手术精度和效率。

参考文献：An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation. Bo Liang. Lifeng Zhang et al, Journal of Neuroscience Methods 2019

       这非常有助于神经科学工作者或研究者利用微型显微镜或双光子显微镜结合显微内窥镜进行活体脑深部成像。

       此外，该设备在体电生理手术实验过程中，可通过设置电机移动速度，非常jing准缓慢地埋植电极，帮助实验者快速记录细胞信号。

       当然，你也可以把它当做普通的电动定位仪来使用，常规的脑部注射等实验都可以用它来完成。

       RWD微型缓释泵可植入到（至少20g重的）动物的皮下。皮下植入时，需先在肩胛骨之间的皮肤上做一小切口。使用止血钳分离皮下结缔组织，形成一处空隙。将泵置入空隙中，流量调节器不要指向切口。皮肤切口可以使用伤口夹或缝线缝合。

       腹腔植入时，在（体重至少为150g的）动物的胸廓下腹中线做一小的皮肤切口。直接向下切开腹肌做另一小切口。将泵植入，流量调节器朝里放入。用缝线缝合肌肉切口，皮肤切口可以使用伤口夹或缝线闭合。需注意的是药物释放期结束、或植入第4*天后必须取出泵。

（*参看系列文章来计算准确的释放时长，以及本批次微型缓释泵的Z长容许置入时间。）

RWD微型缓释泵使用注意事项

1.部分或完全排空的RWD缓释泵不得再重新灌充或再次使用。

2.使用时，RWD缓释泵必须充满药液，并记录灌充量。

3.确保使用的溶剂-药品混合液（即药液）与泵的内部材料的相容性。

4.在整个试验期间内，使用的药物应能在37°C的基质溶液内保持稳定。

5.药物释放的速率按以下等式计算：

ko = Q • Cd

       其中，ko是泵中溶液的质量释放速率（µg/h），Q是泵中溶液的容积释放速率（µl/h），Cd是溶液中药剂的浓度（µg/µl）。

6.RWD缓释泵已经过了60Co放射源的辐射灭菌处理。微型缓释泵在灌充、操作和外科植入时应遵守规范的灭菌标准。

7.如果希望缓释泵立即启动、或者使用的是粘稠溶液、又或者希望连上导管使用，可将泵放入37°C的无菌生理盐水中保温至少6到8个小时（Z好放置过夜）。

8.如果缓释泵即将工作的环境的温度与正常哺乳动物体温（37°C）以及渗透压度（310mmol/l）存在显著差异时，RWD泵的泵送率会受到影响。

9.2003D型RWD微型缓释泵应在释放期结束后或植入第4*天后取出。否则，在此时间之后，会不断有水被吸入泵中，泵可能会膨大起来，渗出高浓度的盐溶液，进而导致泵周围的局部刺激。

10.通过配合导管使用，RWD缓释泵可用来将物质释放入静脉或动脉循环、大脑、器官、内腔或实体组织中。

11.RWD缓释泵是否正常工作可通过在试验过程中监测血药浓度、试验结束时检查残余溶液量、或体外试验来验证。

       为验证缓释泵是否在实验过程中连续给药，建议RWD缓释泵的用户在整个给药过程中的几个时间点检测药物的血液浓度。如果不可能检测循环血液中的浓度，或技术上不可行，还有几种替代方案可供选择。

       注意，未装满或已排空的泵的重量不能用于检测药物泵出量，因为此时的泵会在工作时吸收水分。类似的，通过切开已用过的缓释泵来判断泵的性能，也是一种不可靠的方法。

A. 平均泵送率的测定

       RWD缓释泵的储药仓比要求的容量稍大，以便能完成整个3天的泵送工作。因此，在泵停止工作后，泵内会残留有一些药液。可使用附带的平头灌充针和1.0ml注射器将这些溶液抽出，并用额外的溶剂冲洗来收回残留的药液。随后即可使用合适的方法对回收药液中的目标药剂进行分析。平均泵送率等于Z初灌充到缓释泵中的药液量，减去结束后泵中的残余药液量，再除以泵送时间。

B. 体外泵送率的测定

       RWD缓释泵有确定的泵送速率，该速率通过将泵置于37°C（± 0.5°C）的等渗盐水中测出。如果用户需要自行检测泵送率，建议遵照以下步骤：

       步骤1：制备一种已知浓度的指示剂等渗盐水溶液。通过缓释泵泵出的指示剂的量，即可算出泵送率。因此，指示剂溶液应与泵的材料相容，且能在溶于等渗盐水时方便地进行分析。（可使用美国FD&C 1号蓝色染料） 

       步骤2：使用指示剂溶液灌充RWD缓释泵。

       步骤3：将RWD缓释泵放入预先已注入15ml等渗盐水的试管中，在37°C（± 0.5°C）的温度下进行预保温处理。盖住试管，以防蒸发。

       步骤4：记录下保温的开始时间，保温6-8小时。

       步骤5：将缓释泵移入新的等渗盐水的试管中，每隔12小时将RWD缓释泵转移到一个新的注入有15ml等渗盐水的试管中。记录下转移的准确时间和/或两次转移之间的间隔。

       步骤6：连续3天时间重复步骤5。

       步骤7：对比已知的浓度标准分析每个试管中指示剂的浓度，计算每个时间间隔内泵出的指示剂的量。根据这一指示剂量和Z初灌充入RWD缓释泵内溶液的指示剂浓度，即可计算出每个间隔泵出的溶液总量。除以每间隔的小时数即可获得每小时的容量泵送率。注：如使用的是FD&C 1号蓝色染料，建议分光光度分析的波长为630nm。

RWD微型缓释泵的工作原理

瑞沃德植入式缓释泵

       RWD缓释泵是一种精确的给药工具。本节将详细说明本批次2003D型缓释泵的实际泵送率和灌充量规格，以及确定具体数值的方法。在6-8小时的启动过渡后，2003D型缓释泵能以恒定的速率（在可预测范围内）将药液泵释放，直到储液仓内只剩5%左右的溶液为止，然后速率下降为零。

       RWD公司用来估算渗透泵泵送率的方法是在体外检测37℃（± 0.5°C）0.9%盐水中缓释泵的泵送速率。这一体外测试法具有良好的可再现性，不管是针对不同时期同一批缓释泵还是不同批次缓释泵的测试，用来估算泵在恒温动物（0.9%盐水为等渗溶液）体内的预计泵送率。例如，在大鼠和小鼠中，植入的微型缓释泵在皮下或腹腔内的泵送率和体外速率的的偏差在5%之内。

A. 体外合格性试验

       从本产品的同一批次中随机选出了20个RWD缓释泵。这些泵请使用后文方法灌充入染料溶液。平均灌充量值，包括标准差见产品标贴。

       在灌充完染料溶液后，将所有RWD缓释泵浸入37°C（± 0.5°C）0.9%的盐水中。八小时后将这些泵再放入装有新鲜盐水的试管中，每12小时换试管一次，连续检测3天。对照标准对每部缓释泵的输出进行分析。在8到80小时（3天）的时间段内，每部缓释泵均以恒定的速率工作。按照RWD公司的经验，每部缓释泵的泵送率的变异系数不会超过10%。产品标签的批次规格中，还包括一个批次内所有缓释泵的体外泵送率平均值及标准差。

B. 启动时间

       如果RWD缓释泵是在室温（23°C）下灌充入同样是室温的溶液，那么放置到37℃的等渗盐水中后，其泵送率在前几个小时内无法达到稳定状态。如果试验需要立即泵送药液，RWD建议在植入前把预先充好药液的泵放入37℃的0.9%盐水中至少6-8个小时（Z好过夜）。如果泵和导管合用，或者释放的溶液为粘稠溶液时，那么必须这样做。

C.泵送时长的确定

       缓释泵的有效工作时长可按以下等式计算：

D = （V/Q）（0.90）

       在此等式中，D是泵送时间（单位：h），V是泵储液槽的容积（单位：µl，见相关规格），Q是泵送率（单位：µl/h）。

       每个缓释泵使用时都必须充满药液，正确的灌充方法详细说明如下。泵的储药仓中有气泡或未插入流量调节器可导致无法预测的泵送速率波动。灌充时药液的温度应该为室温。

       建议在灌充和操作RWD缓释泵时以及进行外科植入手术时遵守规范的灭菌方法。针对药液的CJ，可使用0.22μm的注射器针头过滤器进行过滤。

       在灌充和植入过程中，握持RWD缓释泵时应戴有手术用手套。泵的表面如果蓄积有大量皮脂，会影响到泵的性能。如果泵的表面受到污染，可在植入前使用70%的异丙醇水溶液擦拭。不要把泵浸没在70%的异丙醇溶液中。

当给RWD缓释泵灌充药液时请遵照以下步骤：

       步骤1：称量空泵（带流量调节器）的重量。

       步骤2：灌充泵时使用小注射器（1.0ml）和附带的27G平头灌充针，使用较大的注射器可能导致灌充速度过快，在储药仓内产生气泡。将药液抽入注射器内，连接上灌充针。注射器和灌充针内不能有气泡。

       步骤3：取下流量调节器，将泵竖直拿在手中，从泵顶端开孔位置将灌充针插入，直到针尖到达缓释泵底部。

       步骤4：向上提起针头1~2mm，缓缓推动注射器的活塞，缓释泵应始终保持垂直。当从出口看到药液溢出时，停止灌充，小心地移出注射器及灌充针。（灌充速度过快可导致储药仓内出现气泡。）

       步骤5：擦净溢出的药液，插入流量调节器，直到白色的法兰与缓释泵的顶端齐平。置入流量调节器时会导致一些药液溢出。擦净溢出的液体。为使缓释泵正常工作，流量调节器必须完全插入泵体。

       步骤6：给充满药液的泵称重。步骤1和步骤6的重量差就是灌充进泵中的溶液的净重。对于大多数稀释的水溶液来说，灌充重量（以mg为单位）应近似于泵的容量（以µl为单位）。灌充量应达到产品标贴上标注的平均灌充量的90%以上。如果灌充重量近似于泵容量，则可以开始使用灌充后的缓释泵了。反之，则缓释泵内可能混入了空气。这时应抽空泵，重新灌充。

       如果灌充时遇到缓释泵内部有压力，可在灌充时将灌充针稍微倾斜一些。也可前后移动灌充针将灌充口扩大一点，或者在插入灌充针前插拔流量调节器几次。

       通过一根导管，RWD缓释泵可将药物释放入静脉或动脉循环、大脑、器官、内腔或其他组织中。连接导管不会影响缓释泵的泵送率。以下为RWD缓释泵与导管合用时的准备步骤：

       1. 取下流量调节器的硅橡胶调节帽，露出在白色法兰之外的一小段不锈钢管。

       2. 将不锈钢管与PE导管连接起来，在连接好后，导管应能包裹住露出在白色法兰之外的整段不锈钢管（约3mm）。导管的内径（I.D.）为0.65mm-0.75mm。PE管适用于大多数应用领域。

       3. 使用注射器灌充导管和连接在一起的调节器，灌充时应从没有连接不锈钢管的一头灌注。灌注好后，将注射器留在导管上，不取下。

       4. 按照上文中的步骤，灌充RWD泵。

       5. 将流量调节器完全插入泵中，直到白色法兰与缓释泵的表面平齐。这时取下导管另一端的注射器。

       6. 将缓释泵置入37℃温度0.9%的盐水中6-8小时（Z好过夜）。这将使缓释泵在植入前即开始工作，将使导管内出现堵塞或形成凝块的可能性降至Z低。如果使用导管，就必须完做这一步。接下来即可将缓释泵和导管植入动物体内。

细胞冻存

       细胞冻存是指将细胞放在低温环境，以达到减少细胞代谢的作用，从而达到对细胞进行长期储存进行保种的目的，以供后续实验或临床使用。

细胞冻存流程示意图

       目前，细胞冻存主要的技术为液氮冷冻法，实际冻存过程中，需要进行梯度温度冻存，并加入适量的保护剂以保证细胞内外的水分不会形成冰晶造成细胞的损伤或死亡。

什么时候可以冻存细胞

       在准备对目标细胞进行冻存前，一定要确保细胞处在Z佳的生长状态，可通过以下几个指标进行观测：

1 培养基的颜色和浑浊情况

       培养基的颜色可以指示细胞是否生长过盛（比如偏黄就说明细胞长的太过）；而培养基出现浑浊情况往往是指示有污染存在，此时是不宜冻存的。

2 细胞培养的时间

       通常情况下，新复苏的细胞建议在2周左右进行冻存，若连续培养超过二个月，性状大概率会发生一些改变，此时的细胞也不适宜冻存。

3 细胞的数目

       冻存时，每只冻存管内细胞Z佳浓度为5x10^6个/ml—1x10^7个/ml，高密度或者低密度对细胞成活率都有一定的影响。细胞数目不足时，不建议冻存细胞。

细胞冻存前需要做什么预处理吗

       细胞被消化离心、去上清收集细胞沉淀后，往往需要用冻存液进行重悬并转移至冻存管。冻存液中一般含有渗透型的保护液如甘油或10%的二甲基亚砜（DMSO）和10%-90%胎牛血清。

       细胞内外主要成分都是水，若不加保护液直接冻存，细胞内外的水分会凝结成冰晶，引发细胞内源性的机械损伤。细胞内水分凝结导致的细胞脱水，也会使得胞内pH值改变、蛋白变性、细胞内器官功能的丧失乃至核内DNA损伤，Z终 极有可能导致细胞的死亡。

       而冻存液往往都是易溶解的小分子物质，具有细胞渗透性，可以穿过细胞膜，进入细胞内，降低冰点，同时又可以提高细胞膜对水的通透性，使得细胞内水分渗出到细胞外，从而减少细胞内冰晶的形成。

       *某些特殊细胞如原代皮肤细胞也会额外添加海藻糖等表面型保护剂，以提高细胞存活率。

       *由于DMSO对大部分细胞无毒性作用，因而在细胞冻存液中被广泛使用；也有少部分细胞部分细胞对DMSO毒性敏感，可以选用甘油作为冻存保护剂。

       冻存液中的另一个主要成分是胎牛血清。由于冻存中的细胞仍旧有微弱的新城代谢，在冻存液中加入血清，可以为细胞提供营养。同时，血清中富含的蛋白等大分子物质可以对细胞有较好的保护作用。实验证明，血清在冻存液中的高比例，有利于提高细胞活力。因而，在冻存过程中可以使用90%的血清加上10%的保护液进行细胞保存。对于常见的易培养细胞系10%到20%的血清再加上一定量的完全培养基和DMSO也可以很好的对细胞进行保存。

细胞冻存的降温过程是怎样的

       细胞冻存过程是一个梯度降温的过程，而其Z终储存的Z佳保冷介质为液氮。液氮的温度可以低至-196℃，在这种低温条件下，细胞的保存理论上是性的。

       缓慢冻结的过程，能使细胞内水分在冻结形成冰晶前透出细胞，因此梯度降温可以大大减少细胞在降温过程中受到的损伤。目前，实验室通用的梯度降温方法以下两类：

1 人工传统降温法

       冻存管置于4℃ 10 min → -20℃ 30 min → -80℃ 16-18 小时（或过夜，Z长放置时间不要超过一个月）→ 转移至液氮长期储存。

       *细胞置于4℃及-20℃的时间不可太长，且从4℃转移至-20℃时，Z好颠倒混匀下细胞，防止细胞大量沉降堆积至管底，影响细胞复苏。

2 借助冻存盒、细胞渐冻仪等工具

       利用其中的介质特性或制冷程序进行自主梯度降温：

       冻存管置于细胞冻存盒（冻存盒需要提前预冷至4℃，需检查其内异丙醇或其他液体是否足量）后放于-80℃冰箱16-18 小时（或过夜，Z长放置时间不要超过一个月）→ 转移至液氮长期储存。

       冻存管置于渐冻仪中以1-2℃/min的降温速率降至-100℃后，→转移至液氮长期保存

使用液氮罐的安全小提示

       液氮（Liquid nitrogen）是液化的氮气，是生命科学研究和医药行业常用的冷冻储存介质，具有以下理化性质：

       01 超低温性：液氮的沸点为－195．8，液氮气化时每公斤可吸热 48 大卡；

       02 无色、无臭、无毒的液体；

       03 窒息性：氮气本身不能致使人窒息，但在一定空间内，如果氮气过多而隔绝氧气，操作者也会引起窒息。

       因而，在操作液氮罐时，需要注意以下安全使用规范：

       01 防止冻伤。虽然它渗透性很弱，但当人体皮肤接触液氮时会受到严重冻伤。在放置细胞时，一定要确保穿戴了厚手套、护目镜、实验服；

       02 操作轻柔，防止液氮溅出；

       03 尽可能地快速操作。由于液氮在空气中会迅速吸热气化，为了避免样品温度变化影响其质量，需尽快操作；

       04 做好维护。定时查看液氮余量，确保罐内液体高度没过重要样品，Z少时，液氮不可少于罐体容积的三分之一。

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在脑科学基础研究领域中，颅脑给药已经成为大多数动物实验的重要环节。根据实验设计，常见有三种给YF式：单次注射给药、多次反复给药和持续释放给药。前者通常采用立体定位仪配合微量注射泵给药，第二种通常采用套管给药，第三种通常通过植入式缓释泵给药。

本文主要介绍套管给药，它主要用于给小鼠、大鼠、猴等实验动物的目标脑区进行反复多次给药，也可结合配套光纤使用（光遗传），在给药的同时或者给药后继续对目标脑区进行光刺激。常应用于人类神经性疾病动物模型、高级脑功能、情感、认知等相关研究。

1.仪器设备与配件

脑立体定位仪、显微镜、冷光源、保温垫、手术垫、套管夹持器、手术器械包、酒精棉球、干棉球、颅钻（包括钻头）、异氟烷气体麻醉系统（或注射麻醉药品）、套管给药系统（导管、注射内管、导管帽、PE管、小螺钉）、微量给药系统（微量注射泵、微量注射器）

大小鼠剃毛器（非必须，可手术剪去毛）、快速灭菌器（主要用于手术器械消毒，避免引起小鼠颅内炎症）、颅骨水平校准器（非必须，主要降低实验上手操作难度）、颅钻夹持器（非必须，可手持颅钻钻孔替代）

2.试剂

碘伏、酒精、双氧水、生理盐水、牙科水泥（牙托水和牙托粉）、抗生素、异氟烷（或注射用麻醉药物）

3.操作步骤

3.1  根据脑图谱或文献确定目标脑区的三维坐标：AP 值（Anterior-Posterior，Y 轴，头部到尾部）、ML 值（Medial-Lateral，X 轴，中缝到两侧）和 DV 值（Dorsal Ventral，Z 轴，背侧到腹侧）。

瑞沃德电动全自动脑立体定位仪

3.2  将动物麻醉，头部固定到脑立体定位仪上（小鼠需要黑色适配器，大鼠无需适配器，直接固定即可）。调平颅骨，而后定位至目标脑区利用颅钻钻孔（同时在孔位附近钻 2-3 个小孔，用于旋入颅钉，作为牙科水泥着力点，防止牙科水泥脱落。同时这些小孔直径需要小于颅钉，这样颅钉才能旋紧，起到提供附着力效果），然后用针轻微刺破目标脑区上方孔德硬脑膜，暴露颅脑；颅钉固定位置硬脑膜无需刺破。将颅钉旋入孔内约三圈，然后将准备好的导管，通过夹持器缓慢植入颅内，再用牙科水泥将螺丝和导管包裹固定。

3.3 等待牙科水泥凝固后（约 15 分钟左右），移除夹持器（注意不要带动导管），并且缓慢插入导管帽，旋紧；根据实际情况判断是否需要缝合皮肤。

3.4  动物恢复期，约 2-3 天即可恢复。在此期间，可在皮肤周围涂抹罗红霉素软膏，防止动物发炎感染；同时注意动物状态，适时腹腔注射补充糖盐，使得动物获得足够多能量。

3.5  将注射内管、PE 管、锁紧螺帽、注射器提前组装好。利用注射泵吸取药物，在PE管上标注药液位置（主要用于注射药物过程中观察药物液面是否下降了）。随后取出导管帽，将注射内管缓慢插入导管，利用锁紧螺帽锁紧。

3.6  设置注射泵的注射量、注射速度，开始注射。注射完毕后，静止约 10 分钟，待药物被充分扩散，然后缓慢拔出注射内管，重新插入导管帽，旋紧。

4.注意事项

4.1 除金属导管帽外，建议对非金属导管帽、导管、注射内管、导管帽芯、锁紧螺帽和 PE 管均可以采用高压蒸汽、紫外、环氧乙烷等方式进行消毒灭菌。

4.2 使用 PE 管前，可以用大头针将 PE 管的一端接头撑大一点或者用酒精泡一小会，便于插入注射内管。插入注射内管时，务必注意的是，PE 管必须套在白色层外层（非金属管外层），否则易脱落、松动，导致漏液；

4.3 因 PE 管、注射内管内部存在死体积，因此在将注射内管、PE 管、锁紧螺帽、注射器组装好以后，插入导管前，应将注射液（比如药物）将 PE 管和注射内管充满，勿出现气泡，以保证注射药量的JZ。操作方法：需要先向前推注射器，直至注射内管前端有液体冒出，才可将注射内针插入导管，注射药物。

5.套管选择

（1）单管  

订货时，务必提前确认以下 4 个参数：

1）D-导管的外径，有 0.64、0.56、0.48、0.41 和 0.71 mm 五种规格供选择。

2）C-导管塑料基座 （B） 基座以下金属管的长度，即动物颅骨表面至目标脑区的垂直距离（单位：mm）。

3）G1-注射内管插入导管后突出部分的长度（单位：mm），一般选择 0.5 或者 1.0 mm。

4）G2-导管帽插入导管后突出部分的长度（单位：mm），一般选择 0 、0.5 或者 1.0 mm。 

（2）双管  

订货时，务必提前确认以下 5 个参数：

1）D-导管的外径，有 0.64、0.48 和 0.41 mm 三种规格供选择。

2）C-导管塑料基座 （B） 下金属管的长度，即动物颅骨表面至目标脑区的垂直距离（单位：mm）。

3）G1-注射内管插入导管后突出部分的长度（单位：mm），一般选择 0.5 或者 1.0 mm。

4）G2-导管帽插入导管后突出部分的长度（单位：mm），一般选择 0.5 或者 1.0 mm。

5）C.C-双导管的ZX间距，即两个目标脑区的水平间距（单位：mm）。

欢迎选购

       在脑科学基础研究领域中，颅脑给药已经成为大多数动物实验的重要环节。根据实验设计，常见有三种给YF式：单次注射给药、多次反复给药和持续释放给药。前者通常采用立体定位仪配合微量注射泵给药，第二种通常采用套管给药，第三种通常通过植入式缓释泵给药。

       本文主要介绍套管给药，它主要用于给小鼠、大鼠、猴等实验动物的目标脑区进行反复多次给药，也可结合配套光纤使用（光遗传），在给药的同时或者给药后继续对目标脑区进行光刺激。常应用于人类神经性疾病动物模型、高级脑功能、情感、认知等相关研究。

一、仪器设备与配件

       脑立体定位仪、显微镜、冷光源、保温垫、手术垫、套管夹持器、手术器械包、酒精棉球、干棉球、颅钻（包括钻头）、异氟烷气体麻醉系统（或注射麻醉药品）、套管给药系统（导管、注射内管、导管帽、PE管、小螺钉）、微量给药系统（微量注射泵、微量注射器）

       大小鼠剃毛器（非必须，可手术剪去毛）、快速灭菌器（主要用于手术器械消毒，避免引起小鼠颅内炎症）、颅骨水平校准器（非必须，主要降低实验上手操作难度）、颅钻夹持器（非必须，可手持颅钻钻孔替代）

二、试剂

       碘伏、酒精、双氧水、生理盐水、牙科水泥（牙托水和牙托粉）、抗生素、异氟烷（或注射用麻醉药物）

三、操作步骤

       1.根据脑图谱或文献确定目标脑区的三维坐标：AP 值（Anterior-Posterior，Y 轴，头部到尾部）、ML 值（Medial-Lateral，X 轴，中缝到两侧）和 DV 值（Dorsal Ventral，Z 轴，背侧到腹侧）。

       2.将动物麻醉，头部固定到脑立体定位仪上（小鼠需要黑色适配器，大鼠无需适配器，直接固定即可）。调平颅骨，而后定位至目标脑区利用颅钻钻孔（同时在孔位附近钻 2-3 个小孔，用于旋入颅钉，作为牙科水泥着力点，防止牙科水泥脱落。同时这些小孔直径需要小于颅钉，这样颅钉才能旋紧，起到提供附着力效果），然后用针轻微刺破目标脑区上方孔德硬脑膜，暴露颅脑；颅钉固定位置硬脑膜无需刺破。将颅钉旋入孔内约三圈，然后将准备好的导管，通过夹持器缓慢植入颅内，再用牙科水泥将螺丝和导管包裹固定。

       3.等待牙科水泥凝固后（约 15 分钟左右），移除夹持器（注意不要带动导管），并且缓慢插入导管帽，旋紧；根据实际情况判断是否需要缝合皮肤。

       4.动物恢复期，约 2-3 天即可恢复。在此期间，可在皮肤周围涂抹罗红霉素软膏，防止动物发炎感染；同时注意动物状态，适时腹腔注射补充糖盐，使得动物获得足够多能量。

       5.将注射内管、PE 管、锁紧螺帽、注射器提前组装好。利用注射泵吸取药物，在PE管上标注药液位置（主要用于注射药物过程中观察药物液面是否下降了）。随后取出导管帽，将注射内管缓慢插入导管，利用锁紧螺帽锁紧。

       6.设置注射泵的注射量、注射速度，开始注射。注射完毕后，静止约 10 分钟，待药物被充分扩散，然后缓慢拔出注射内管，重新插入导管帽，旋紧。

四、注意事项

       1.除金属导管帽外，建议对非金属导管帽、导管、注射内管、导管帽芯、锁紧螺帽和 PE 管均可以采用高压蒸汽、紫外、环氧乙烷等方式进行消毒灭菌。

       2.使用 PE 管前，可以用大头针将 PE 管的一端接头撑大一点或者用酒精泡一小会，便于插入注射内管。插入注射内管时，务必注意的是，PE 管必须套在白色层外层（非金属管外层），否则易脱落、松动，导致漏液；

       3.因 PE 管、注射内管内部存在死体积，因此在将注射内管、PE 管、锁紧螺帽、注射器组装好以后，插入导管前，应将注射液（比如药物）将 PE 管和注射内管充满，勿出现气泡，以保证注射药量的jing准。操作方法：需要先向前推注射器，直至注射内管前端有液体冒出，才可将注射内针插入导管，注射药物。

五、套管选择

1.单管  

订货时，务必提前确认以下 4 个参数：

       1）D-导管的外径，有 0.64、0.56、0.48、0.41 和 0.71 mm 五种规格供选择。

       2）C-导管塑料基座 （B） 基座以下金属管的长度，即动物颅骨表面至目标脑区的垂直距离（单位：mm）。

       3）G1-注射内管插入导管后突出部分的长度（单位：mm），一般选择 0.5 或者 1.0 mm。

       4）G2-导管帽插入导管后突出部分的长度（单位：mm），一般选择 0 、0.5 或者 1.0 mm。 

2.双管  

订货时，务必提前确认以下 5 个参数：

       1）D-导管的外径，有 0.64、0.48 和 0.41 mm 三种规格供选择。

       2）C-导管塑料基座 （B） 下金属管的长度，即动物颅骨表面至目标脑区的垂直距离（单位：mm）。

       3）G1-注射内管插入导管后突出部分的长度（单位：mm），一般选择 0.5 或者 1.0 mm。

       4）G2-导管帽插入导管后突出部分的长度（单位：mm），一般选择 0.5 或者 1.0 mm。

       5）C.C-双导管的ZX间距，即两个目标脑区的水平间距（单位：mm）。

详细的颅脑给YF式，请点击查看

//三血管阻塞模型

急性脑缺血动物模型是研究脑血管病病理机制和FZ措施不可缺少的工具。由于临床上缺血性卒中大多是由于大脑中动脉区域梗死造成，因此人们普通采用血管内线栓法模型，但是由于该模型制作变异性大，而且动物长期存活率低，致使实验重复性差。

后来经过学者们不断的摸索优化，发明了开颅后夹闭大脑中动脉(而非电凝)联合双侧颈总动脉夹闭的大鼠三血管阻塞模型(3-vessel occlusion， 3-VO) ，由于该方法可同时导致大鼠皮质和基底节缺血，被认为是最接近人类卒中的标准动物模型，适用于脑缺血后长期神经功能缺失的康复及介入ZL研究中。另外，该模型因其缺血较为迅速、缺血效果好、再灌注血流恢复迅速而更加适用于急性缺血性疾病的研究。

//动物选择

•小鼠：C57BL6J  CD-1等小鼠，常用雄性小鼠，体重25-35g

•大鼠：Sprague-Dawley(SD)、Wistar等多种小鼠，常用雄性大鼠，体重250~350g

//制作步骤

1.大鼠手术操作步骤

•将大鼠置于手术台上,取仰卧位,用10m注射器大小的管子放置在大鼠颈后,以加强双侧颈总动脉的显露。

(1)剃掉颈部和腹侧的毛,用75%的乙醇棉球或聚维酮碘进行局部皮肤消毒,颈部中线做一个切口,分离双侧颈总动脉,双动脉下穿线;分离颈总动脉时小心分离伴行的迷走神经纤维,以免受损伤。

(3)将大鼠体位改为左侧卧位。

(4)在大鼠右眼滴加1~2滴人工泪液,闭上眼睑,避免手术中对眼睛造成损伤;剃掉右侧外耳道和右眼外之间的皮毛,使用聚维酮碘局部皮肤消毒,75%乙醇脱碘,在两个位置连线中点做一切口,长度约2cm。

(5)用止血钳拉开切口,切断颞肌,分离肌肉,暴露颧弓。操作工程中要注意保护腮腺和面神经。

(6)用咬骨钳移除颧弓,用牵张器撑开下颌骨与颧弓,暴露前庭窗;用1.4mm钻头的骨钻在前庭窗的前3mm、下1mm处钻孔,钻头浸在室温的盐水中,以免在钻洞过程中造成皮质热或物理损伤。在显微镜下透过硬脑膜即可看见大脑中动脉,垂直于嗅束向上走行。

(7)用针头挑破硬脑膜,分离大脑中动脉周围的蛛网膜,暴露大脑中动脉。用显微镊在接近嗅束处将大脑中动脉挑起,用无创微动脉夹夹闭或尼龙线结扎大脑中动脉,夹闭结扎位置在其分支豆纹动脉之前或靠近颈内动脉处。将颞肌和表面皮肤覆盖回位,用浸透人造脑脊液的纱布覆盖。

(8)在阻断大脑中动脉同时,通过尼龙线套扣阻断双侧颈总动脉的血流(见图1和图2)。

(9)缺血1~2h后颈总动脉的动脉瘤夹/缝线和大脑中动脉的缝线都被松开,在显微镜下直接观察3个动脉血流的恢复。

 (10)再灌注20min后,用牙科胶泥封闭颅骨手术,再分别缝合切口。允许大鼠麻醉苏醒后自由进食水。所有大鼠在能通风换气的(24±0.5)℃孵箱中直到实验结束。

图1三血管阻塞模型操作步骤

(a)  在左侧眼外眦至外耳道之间做长约2cm的切口;(b)暴露颞肌,纯性分离并牵开颞肌；(c)以卵圆窝或者下领神经前方3cm、侧方1cm的鳞骨为ZX，钻一直径为2~4mm的小孔；(d)移去颅骨；(e)暴露大脑中动脉区域；(f)剪开需扎闭区域周围硬脑膜，用10-0或11-0的带针缝合线结；大脑中动脉；(g)手术示意图；(h)结扎双侧颈总动脉。

图2三血管结扎示意图

注:双侧颈总动脉、右侧大脑中动脉结扎造成大脑中动脉区域持续、稳定的缺血

2.小鼠手术操作步骤

小鼠的手术操作流程与大鼠基本相同，不同之处是用更小的动静脉畸形血管夹。

//注意事项及常见问题解答

1.注意事项

•麻醉剂对梗死体积的作用

在麻醉和手术过程中对大脑缺血模型都是有影响的。麻醉剂在大脑缺血的病理生理中有重要作用。因此,笔者比较了不同麻醉剂对缺血梗死体积的影响,发现水合氯醛是这模型的理想麻醉剂。

水合氯醛是镇静剂，用于ZL失眠的短效药物，可缓解焦虑，在手术前诱导睡眠或ZL乙醇戒断症状，也可用于术后缓解疼痛。用水合氯醛比用其他的麻醉药(如氯 胺 酮、赛拉嗪、乙 醚和异氟醚)模型的梗死体积和结扎时间有更好的相关性。水合氯醛的另一优点在于不是管制药品,在购买和存放时减少了很多限制要求。

•血糖对梗死体积的影响

在临床研究中发现，血糖水平是缺血脑损伤一个主要的决定因素。三血管MCAO模型也证实血糖水平对缺血结果有重要影响。高血糖导致梗死体积明显增大，并且高血糖是缺血期间最有害的因素，反之低血糖则能减少梗死体积。在ZL窗内使血糖恢复正常能有效减少梗死体积。

然而，血糖对脑缺血作用的分子机制还不清楚。缺血前禁食24h能减少缺血24h后的脑损伤,这一作用持续至再灌注后28d。尽管COX-1基因ZL能在缺血24h后减少大脑梗死体积，但是在再灌注后的28d未见其持续的保护作用。这些结果均表明血糖对缺血脑损伤有重要作用,且是评价缺血的远期预后的一个重要因素。

•脑水肿对梗死体积的影响

在局灶性脑缺血的动物模型中，通过特殊组织染色观察每一个脑片的梗死部位，通常通过测量这些梗死面积来确定梗死体积。

形态学测定分析梗死体积是一个客观并且定量的评估缺血脑损伤程度的方法，同时这种方法在临床前的研究中常被用于判断神经保护剂的有效性。然而，肿胀的缺血组织可能导致测得的梗死区域增大，因此高估了实际的梗死体积。把脑水肿包括在梗死体积内计算可使实际的梗死体积增加多达22%。

因此，因脑水肿引起的梗死体积失真可能使得干预ZL的有效与否难以解释。可通过测量皮质的水含量和MRI确定在这一模型缺血损伤后的1~3d脑水肿的严重程度来减少因脑水肿导致的误差，Swanson等提出了一种基于正常存活的灰质体积来计算梗死体积的方法，这一方法进一步被林等证实。

显然，以前直接测量梗死体积的方法在缺血后前3d脑水肿进展期间所测得的数据要高于实际梗死体积，这一误差能通过基于对非梗死皮质体积的间接测量得以减少。

•性别对梗死体积的影响

流行病学研究发现，女性(直至绝经后,即55岁后)心血管病的患病率低于男性，卒中的发病率也是如此。有短暂性缺血发作或小卒中的女性发病率低于男性。动物研究也表明性别不同，卒中的结果不同。在三血管MCAO模型中，雄性比雌性大鼠的梗死体积更大。当在三血管MCAO模型中混有雄性和雌性大鼠时，应该考虑性别的影响。

•温度对梗死体积的影响

研究发现，即使是轻微的大脑温度降低，也能对缺血损伤的大脑起到保护作用。Connolly等的研究显示，MCAO模型后，小鼠无法自我调节体温，在保护期出现严重的低温，而这种体温变化对MCAO模型后病理结果有显著的影响，是损伤了下丘脑体温调节中 枢所致。

2.常见问题及解决方法

•梗死面积太小

在该模型中，选择截断大脑中动脉主干血流的部分十分重要。实践经验认为只有在鼻裂间隙正上段部位的血流阻断才能得到相对合适的梗死范围。

•损伤脑组织或出血

在手术阻断大脑中动脉主干时，电凝或结扎该血管都很容易造成邻近此血管的脑组织损伤，如果电凝不到位或结扎过于用力，或手术操作粗暴，都极易损伤大脑中动脉主干，从而导致大出血，使手术失败。

*以上内容部分源自《实验卒中模型方法学》

书号：ISBN 978-7-313-21776-9

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荧光成像需要对检测的细胞或分子进行荧光标记。标记方法主要有两种，DY种利用内源荧光信号，在细胞中表达荧光蛋白进行标记；第二种利用荧光分子对细胞、药物或纳米颗粒等分子进行标记。目前，很多荧光蛋白被开发并应用到活体成像，如何选择合适的荧光蛋白呢？本期将为大家介绍！

Rainbow of fluorescent proteins [Tsien lab]

 选择荧光蛋白应考虑的五大因素

1  激发波长/发射波长

每一种荧光蛋白都有其独特的激发波长和发射波长。因此，选择的荧光蛋白必须是所用成像系统能够激发和检测到的。比如，使用的成像系统只有两个激发光源：488 nm和561 nm。那就不可以选择远红外荧光蛋白。同时使用超过一个荧光蛋白时，必须确保发射波长没有重叠。

荧光蛋白应用于活体成像实验时，尽量选择红色或近红外的荧光蛋白，这类荧光蛋白的发射波长较长，具有更好的组织穿透能力。

2  寡聚反应

早期开发的荧光蛋白易于寡聚化，与目的基因融合表达时，可能会影响目的基因蛋白的生物学功能。建议使用单体的荧光蛋白，比如mCherry。

3  亮度

荧光蛋白的亮度值由消光系数与量子产率的乘积计算得出。在许多情况下，将荧光蛋白的亮度与EGFP(设定为1)进行比较，有一些荧光蛋白非常暗淡（例如TagRFP657，其具有亮度只有0.1）。因此活体成像实验时，亮度也需要考虑。

4  pH稳定性

如果计划在酸性环境中表达荧光蛋白，则此参数非常重要，一些荧光蛋白具有不同的激发/发射光谱（例如mKeima），或在pH变化时荧光强度会发生改变（例如pHluorin，pHTomato）。

5  避免自发荧光

生物体自身的很多物质具有较强的自发荧光，如指甲、毛发具有强烈的绿色背景信号。因此活体成像时，需要对动物进行完全脱毛处理或尽量避免绿色荧光蛋白，可选RFP、dsRed, mCherry, mTomato等荧光蛋白。

选择好荧光蛋白后，接下来就是做实验了。
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1  应用清晰

FOBI 整体荧光成像系统专业用于荧光成像，针对荧光成像应用而设计。内置四种不同的荧光通道：蓝 (460 nm)、绿 (520 nm)、红 (630 nm)、红外 (730 nm)，可对各种荧光蛋白和染料的进行检测。

2. 小巧方便、性能稳定

仪器整体结构紧凑，性能稳定，体积小，重量轻，占用空间小。尺寸 : 260 x 260 x 400 mm；重量仅9 kg。结构设计合理，采用LED漫射型光源，使样本受到均匀激发，相对定量分析更加准确。

3 . 实时，真彩色

SONY 140万像素真彩色CCD，能使荧光信号的观察更加直观、清晰。系统具备录制视频功能，可实时观测动物状态，或实时进行动物手术操作。

成像结果展示

对绿色荧光蛋白表达的肿瘤与Cy5.5标记的药物进行成像

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本文节选自杨国源主编的《实验卒中模型方法学》

书号：ISBN 978-7-313-21776-9

大鼠

       (1) 麻醉成功后以仰卧位固定于手术台,常规备皮、消毒,取颈部正中切口,颈正中切口,钝性分离颈部腺体组织、筋膜,暴露并分离颈总动脉( common carotid artery,CCA)、颈外动脉( external carotid arter,ECA)和颈内动脉( internal carotid artery,ICA)。

瑞沃德呼吸&麻醉解决方案

       (2) 分离ICA及其颅外分支翼颚动脉,结扎翼颚动脉,保持CCA的唯yi分支ICA的开放。

       (3) 游离ECA主干,电凝闭塞ECA的分支,结扎远心端并将其离断。在ECA残端用眼科剪剪开一“V”型小口,剪口之前用微动脉夹夹闭CCA和CA。将预处理过(浸泡肝素)的长2cm的4-0线栓小心地从ECA插入。

MCAO线栓

       (4) 去除ICA的微动脉夹后,插入尼龙线栓直至大脑中动脉的起始处,线栓插入17-18mm(见下图)。根据笔者的经验,线栓插入的长度应根据动物体重,如260~280g大鼠,插入深度约17mm,280g以上的大鼠,插入深度约18mm,总之,以遇到轻微的阻力为准,此时线栓正好进入颅内的大脑前动脉,阻塞大脑中动脉的开口。

MCAO线栓法模型操作主要步骤示意图

(a) 在左颈外动脉远端做一切口,将线栓向颈总动脉方向插入,直至分叉口;

(b) 剪断颈外动脉后,将线栓以颈总外/颈内分又口为圆心逆时针旋转180°角,同时结扎翼膠动脉;

(c) 沿着颈内动脉方向进线,当达到15mm时要非常小心,缓慢进线,直至感觉到有轻微阻力为止。

       (5) 若要恢复大脑中动脉的血流,只需把线栓拔出,使头端退到颈外动脉,颈总动脉的血流就可以再灌注到大脑中动脉。

       (6) 结扎消毒后逐层缝合皮下组织和皮肤,等动物麻醉苏醒后放回笼中即可。

       (7) 手术结束后应用激光散斑血流成像仪监测大脑皮层血流,当看到大脑皮层血液血流降低70%~80%,说明模型制备成功。

       (8) 对照手术模型的制作步骤同前,但血管分离后不插入线栓,结扎消毒后缝合皮下组织及皮肤即可。

小鼠

       小鼠MCAO模型的制作与大鼠的基本相同,可不结扎翼颚动脉,而是在进线栓时调整角度小心避开。其他不同之处在于,线栓为5-0到8-0(除5-0外,通常都需要包裹硅胶),长度为15mm。根据动物体重的具体情况,线栓插入颈内动脉(10±0.5)mm即可,保证线栓正好进入颅内的大脑前动脉,阻塞大脑中动脉的开口。

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