请教流式细胞的具体实验步骤
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本人是diyi次做流式,所以请各位能帮个忙,具体步骤是什么 问题补充:(补充时间:2010-01-06 17:07)
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- 巧慧12 2017-09-11 20:38:34
- 一 、细胞表面标记的检测 1.试剂平衡至室温。准备:消毒台面;穿戴工作服,帽子,口罩和手套,放置棉签,草纸和有盖垃圾桶(内装有消毒剂)。 2.写编号纸并编号。1----IgG1/ IgG1/ IgG12----CD4/CD8/CD33----CD14/CD454---- 3.每管加相应的抗体10l/每种和50l全血,震荡,室温避光20分钟。加血前摇匀血样。 4.加入溶血素1ml,震荡后室温避光10分钟。 5.离心,1200转, 5分钟。弃上清,震荡。 6.加入PBS洗液2ml,震荡,离心,1200转, 5分钟。弃上清,震荡。 7.加入PBS 900l。上机前4度保存。 8.上机。 二 、细胞内细胞因子的检测 1.准备:消毒台面;穿戴工作服,帽子,口罩和手套,放置棉签,草纸和有盖垃圾桶(内装有消毒剂)。 2.写编号纸并编号。IgG1/ CD8/CD3IFN-gamma; /CD8/CD3 3.(3-5在超净台操作)取出PMA(1∶100),BFA(1∶10)和离子霉素(1∶10),使用无菌无叠氮钠PBS稀释储存液。 4.刺激:取全血或PBMCs(细胞数在0.5-1 106 )50l/管,再加入50l RPMI1640进行稀释一倍,加入刺激剂PMA,离子霉素和BFA,混匀。Z后在全血中的终浓度:PMA:50ng/ml离子霉素:1g/mlBFA:10g/ml。 5.37℃,5% CO2 ,4小时孵育(Z好用培养箱,松盖) 。 6.胞外染色:各管中加入相应的表面抗体20l和激活的全血100l混匀,室温避光20分钟。 7.溶血:每管加入溶血素2ml,室温避光10分钟。离心,1200转, 5分钟。弃上清。 8.破膜通透:每管加入0.5ml通透剂,室温避光10分钟。加入2mlPBS,1000转,离心5分钟。弃上清。 9.胞内染色:加入IFN-gamma;或IgG1的抗体20l,混匀,室温避光30分钟。加入2ml PBS,1000转,离心5分钟,弃上清。 10.加入PBS 500l。上机前4度保存。 11.上机检测。 注意:本实验室可提供流式细胞检测服务或流式细胞仪,不会的新手可以自行上门观察.本实验室为正规三甲医院科研共享平台,所有开放的实验均为本实验Z常规的技术服务,暂时开放的除了流式细胞术外还有荧光定量pcr,ChIP免疫沉淀,wester blot,细胞培养,细胞株.
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