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  609613349 2016-07-04 00:00:00

  E.Z.N.A. Total RNA Kit I 步骤 A． 真核细胞和组织 自己需要的材料： β－巯基乙醇、70％乙醇（DEPC水配置）、除RNase的枪头和EP管。 材料的Z佳量 想得到Z佳的产量和好的Hibind RNA柱的纯化效果，选用正确的细胞和组织量是Z重要的。Hibind RNA柱的Z大处理量是可变的，根据细胞和组织的类型。Z大的结合能力是100ug的RNA。TRK裂解缓冲液的Z大裂解能力是1*107个细胞或30mg的组织。 细胞的步骤 1． 用500ul的TRK裂解缓冲液裂解细胞（≤1*107），使细胞团松散，轻轻弹EP管或者用枪头吹旋，再用漩涡振荡混匀。 a) 使用前每1ml TRK裂解缓冲液加入20ul的β－巯基乙醇。 b) 如果是单层的组织培养细胞（成纤维细胞，内皮细胞等），可以直接在细胞培养器里裂解细胞。完全吸去培养基后直接加TRK裂解缓冲液至细胞中。加700ul的TRK到T35细颈瓶或250px的培养皿中，更小的培养器加500ul的TRK。将液体布满整个器皿表面，确保细胞裂解完全。将裂解产物转移至1.5mlEP管中。 c) 如果细胞是悬液培养，收集细胞（≤1，500rpm or 400*g）*5min，弃上清，加入TRK裂解液，漩涡振荡混匀，转移到1.5ml EP管中，进行步骤2。 2． 匀浆化裂解产物 “裂解和匀浆化样品”－第四页有详细的说明，如果细胞≤1*105，漩涡振荡1min。不完全使样品匀浆化会显著的减少RNA的产量还容易造成柱子堵塞。 a) 用匀浆器30 s，使样品匀浆化。 b) 用钝的针头的注射器（0.9mm直径），至少吹打5次是样品匀浆化。注射器要除RNase。 3． 将匀浆后的裂解产物转移至Homogenization Spin Column中，离心，≥1，4000*g， 3min，室温。将离心收集的流出液转移到新的EP管中。转到总RNA分离中第4步。 组织的步骤： 1． 用500ul的TRK裂解缓冲液裂解细胞（≤30mg），使用前每1ml TRK裂解缓冲液加入20ul的β－巯基乙醇。 500ulTRK裂解液Z大裂解能力30mg，难破碎的组织大于20mg就用700ul的TRK裂解液。当组织量超出建议的Z大量时，也不要超过40mg。 组织样品匀浆化参照第四页选择一种方法只用，除非是使用液氮， 2． 离心，≥1，5000*g， 5min， 室温。 3． 转移上清至，Homogenization Spin Column中，离心，≥1，3000*g， 3min，室温。将离心收集的流出液转移到新的EP管中。 总RNA分离： 4． 在裂解产物中加入50％体积（250ul－350ul）的无水乙醇（96％－100％）混匀，漩涡振荡20s。 5． 样品转移到Hibind RNA Mini column上，离心管的Z大容量为750ul，加完乙醇后可能会形成沉淀。所以要充分振荡将所有的混合液加入到柱子上。室温离心，10，000*g，0.5-1min。弃去流出液（透过柱子流出到离心管里的液体）。 6． 将柱子放在一个新的2ml收集管中，加上300ul RNA wash buffer I。室温离心，10，000*g， 0.5-1min。同样弃掉流出液。 7． DNase I 消化（选择性） 在我的实验中没有做这一步。 8． 将柱子再放到一个新的2ml收集管中，加入400ul RNA wash buffer I， 室温离心，10，000*g， 30s，弃流出液。 9． 将柱子放到2ml收集管中，加入500ul RNA wash buffer II（乙醇稀释过的），室温离心，10，000*g， 30s，弃流出液。注意：使用前RNA wash buffer II 必须要用无水乙醇稀释(48ml)，按照标签上的说明。 10． 用500ul RNA wash buffer II洗涤一次柱子，同上一步骤一样。室温离心，10，000*g， 30s，弃流出液。然后在空收集管中，以Z大转速离心柱子，≥12，000*g， 2min， 室温，使的HiBind 基质完全干燥。 11． 转移柱子到一个新的1.5ml的Ep管中，（试剂盒中没有提供），加入50－100ul的DEPC水洗脱柱子（试剂盒中提供）。确保水直接加到了柱子的基质上。10，000*， 1min， 室温。如果RNA的总量大于30ug，可以进行二次洗脱。 注意：可以选择性地，用大一点的体积洗脱RNA。如果进行二次洗脱，总RNA的量会增加，但是浓度会降低，因为80％以上的RNA会在diyi次时被回收。在加柱子前将水加热到65℃并室温孵育柱子5min会增加产量。

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