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新型冠状病毒（2019-nCoV）肺炎疫情来势汹汹，牵动着每一个人的心，在这没有硝烟的抗疫战场上，ZL药物是白衣天使手中的武器。我们整理了基于Orbitrap超高分辨质谱在抗病毒单克隆抗体药物中的应用，谨以此文致敬白衣天使和深耕医学研究的学者。

得益于医药科研工作者的努力，很多药物已经用于新冠肺炎的ZL。比如ZL性新冠特免血浆制品投入临床，接受ZL的10余名危重病人ZD指标全面向好，给危重病人提供了一种很好的ZL方案。在血浆制品中，只有针对病毒表面蛋白质的抗体才可能产生抗病毒的效果，即针对病毒的中和抗体。而大部分抗体缺乏抗病毒效应，他们可能带来细胞因子风暴的副作用。此外血浆制品的另一个缺点是难以量产。因此，鉴定出的中和抗体可以用于疫苗和单克隆抗体药物的开发，弥补血浆制品的不足。

如何在多克隆抗体中找到抗病毒作用的中和抗体？小编收集了基于Orbitrap高分辨质谱方法鉴定血清中单克隆抗体的相关文献，包括蛋白质组学的方法，蛋白质从头测序（De novo测序）、Top-down（自上而下）和Middle-down（自中而下）质谱技术。此外本文还简述了后续单克隆抗体初期研发和生产质控中基于Orbitrap高分辨质谱的全面、深入表征的解决方案。希望对医药科研工作者有所帮助。

方法1 蛋白质组学方法直接鉴定血清中单克隆抗体，应用于单克隆抗体药物的研发

Bottom-up（自下而上）蛋白质组学即先将蛋白酶解成肽段，然后通过色谱分离肽段混合物，再用质谱技术将肽段碎裂，根据碎裂谱图的离子峰信息进行数据库搜索来鉴定肽段，Z后将鉴定的肽段进行组装、重新归并为蛋白。

本文提供了一种结合蛋白质组学和高通量测序技术(NGS)的方法直接从免疫动物血清的外周多克隆抗体中鉴定抗原特异性的单克隆抗体的方法。

技术路线：

基于赛默飞 Orbitrap高分辨质谱仪的蛋白质组学技术进行免疫动物血清中单克隆抗体的鉴定（实验路线见下图）。免疫动物的血清用proteinA或G进行抗体亲和纯化和抗原亲和纯化，纯化后的多克隆抗体分别用多种酶酶切成肽段，接下来用nanoLC-Orbitrap HRMS分析。此外用高通量测序技术对免疫动物B细胞测序获得免疫球蛋白可变区(V-region)的序列，从而得到相对应的蛋白质数据库。质谱数据通过SEQUEST搜该数据库得到可变区氨基酸序列。接着在单一开放阅读框抗体表达平台合成和克隆抗体的重链和轻链。重组单克隆抗体在重链和轻链的基质中排列组合表达，与原多克隆抗体混合物的特异性和活性进行比较从而筛选出高活性的单克隆抗体。本文提供了一种有效分离病毒中中和抗体的方法，用于抗病毒的ZL。并且，它促进我们更加深入理解体液免疫反应。

技术路线图

方法2 蛋白质De novo测序用于单克隆抗体的鉴定，应用于单克隆抗体药物的研发

蛋白质De novo测序：将蛋白分别用多种蛋白酶酶解成肽段，然后通过色谱分离肽段混合物，再用质谱技术将肽段碎裂，直接从碎裂谱图来推断多肽序列，再推断出蛋白序列。可以解决未知序列的蛋白质分析。

本文介绍了一种新利用蛋白质De novo测序的抗体发现的方法，这种方法只需要血清抗体，而不需要对遗传物质进行高通量测序。

技术路线：

基于赛默飞 LTQ-Orbitrap高分辨质谱仪对巨细胞病毒感染人体的多克隆抗体从头测序得到单克隆抗体（实验路线见下图）。巨细胞病毒感染人体后产生多克隆抗体，多克隆抗体用proteinA进行亲和纯化和糖蛋白B抗原亲和纯化富集，用pH 3的洗脱液洗脱，再用离子交换色谱对高丰度的抗体进一步纯化，分别用多种酶对纯化的抗体进行胶内酶切成肽段，接下来用nanoLC-Orbitrap HRMS分析。对抗体MS/MS数据De novo测序分析，再结合分子量的信息筛选出可能的抗体序列组合，再在哺乳动物细胞中表达这些抗体，然后用ELISA实验对重组单克隆抗体进行功能验证。

技术路线图

方法3 Top-down和Middle-down质谱技术用于单克隆抗体的鉴定和序列确证，

应用于单克隆抗体药物的研发和确保抗体药物质量

Top-down质谱技术：蛋白无需酶解，通过完整蛋白质的质量及其碎裂谱图信息可以实现真正意义上的蛋白质鉴定，能保留多种翻译后修饰之间的关联信息。Middle-down质谱技术：蛋白用某些生物酶酶解，得到较长的肽段，对长肽段进行质谱分析，降低了Top-down的难度。

本文利用Top-down或Middle-down质谱技术可以解决高通量测序技术和Bottom-up蛋白质组学技术只能获得单抗轻链和重链的单链信息，而不知道轻链和重链是如何配对的问题。克服了单克隆抗体药物的发现和开发中重链和轻链配对确定的挑战。

技术路线：

基于赛默飞 Orbitrap高分辨质谱仪的Top-down和Middle-down技术对IgG1 Fab段进行序列鉴定（实验路线见下图）。IgG1单抗用GingisKHAN蛋白酶酶切得到单抗Fab和Fc片段，用RP-LC C4色谱柱分离，赛默飞 Orbitrap高分辨质谱仪对Fab进行ETD直接碎裂，从而得到配对的轻链和重链信息。该方法可以用于对来自复杂抗体混合物中的单抗疫苗和药物的发现。

技术路线图

方法4 单克隆抗体药物全表征，确保单克隆抗体药物质量

基于Q Exactive高分辨质谱仪平台和 BioPharma Finder 数据分析软件，实现了单克隆抗体药物简单、快速的完整分子量，亚基分子量，肽图，二硫键和糖型的分析（实验路线见下图），为单克隆抗体药物的初期研发和生产质控提供了GX、可靠的分析测试方法，赛默飞具有完整、全面的生物制药表征解决方案（Thermo AN-21919 & Thermo PN-64805等）。基于Orbitrap高分辨质谱仪的肽图和分子量分析，主要避免抗体氨基酸序列突变或丢失的克隆，确定蛋白分子的正确性。二硫键分析确保抗体空间结构的正确，防止二硫键错配影响单克隆抗体的活性。有的单克隆抗体中糖基化对活性非常敏感，糖型分析可避免一些糖型较差的克隆。

综上所述，基于Orbitrap高分辨质谱的蛋白质组学、蛋白质De novo测序、Top-down和Middle-down质谱技术可以用于单克隆抗体药物的发现和鉴定。以及在后续单克隆抗体初期研发和生产质控中，Orbitrap高分辨质谱平台可以帮助企业对其进行深入、全面的表征，从而保证抗体药物的有效性和安全性。

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2023 年 6 月 9—13 日，杭州迎来了一场学术界的盛世——中国质谱学术盛会。赛默飞新品 Orbitrap™ Astral™ 高分辨质谱仪首次震撼亮相，发布会期间，吸引了多位院士以及 200 多位质谱专家学者的共同见证，共同探讨颠覆性的质谱技术和学术成果。

新品震撼亮相

从左至右：周昕 赛默飞色谱质谱高级商务总监 方向研究员 中国物理学会质谱分会理事长、中国计量科学研究院院长 陈洪渊院士 南京大学  张玉奎院士 中国科学院大连化学物理研究所 周晓斌 赛默飞中国分析仪器事业部中国区商务副总裁

在这场盛大的发布会上，中国物理学会质谱分会理事长方向研究员、中国科学院大连化学物理研究所张玉奎院士和赛默飞中国分析仪器事业部中国区商务副总裁周晓斌先生分别为新品发布致辞，赛默飞高级市场经理范超先生对该款仪器性能做了重磅揭秘。

方向研究员在致辞中表示，Orbitrap Astral 高分辨质谱仪在 2023 美国质谱年会首发，在行业内即引起了轰动，今天很期待现场一睹它的真容，并分享了与赛默飞 1985 年在不莱梅菲尼根结缘的故事，感谢赛默飞在质谱领域的贡献，期待赛默飞未来能推出更多、更好的质谱仪器，支持中国质谱产业的发展。

张玉奎院士首先祝贺 Orbitrap Astral 高分辨质谱仪诞生，这台仪器的问世，必定是蛋白质组学发展一个新的里程碑，对蛋白研究在高覆盖、高灵敏度及高通量等方面给予全面助力，非常感谢赛默飞公司在中国市场推出先进的产品，期待它能够在中国市场更快地展现魅力。

周晓斌副总裁首先对各位院士、专家的到来表示热烈欢迎和感谢，表示赛默飞在质谱领域一直深耕，从最 早 Orbitrap 发布，经过十五年的努力，到今天实现 Orbitrap 与新型分析器 Astral 的结合，隆重推出全新的产品，大幅提升蛋白用户体验。未来希望在新品推出及本土化做出更大的贡献，能够对人类做出更大的贡献，能够对中国的科技发展做出更大的功能。

范超经理介绍了具有颠覆性意义的 Orbitrap Astral 高分辨质谱仪，并带来了美国质谱年会上关于该款仪器的最 新消息总结，让现场 200 余位专家可以领略到全 球市场对于该款仪器的热情。其中包括更快的达到高通量，更深度的覆盖率，更高的灵敏度及提供前所未有的准确度和精确度等信息，让在坐的客户惊讶之余更是感慨，Orbitrap Astral 高分辨质谱仪可以重新书写蛋白质研究思路，为蛋白质组学迈上新台阶创造了条件。

发布会期间，周晓斌副总裁为中国区 Orbitrap Astral 高分辨质谱仪首单用户现场颁发纪念证书，恭喜天津诺禾致源科技有限公司，组学业务如虎添翼！

大会报告

赛默飞前沿质谱技术及创新应用论坛

6 月 9 日下午，赛默飞举办的前沿质谱技术及创新应用论坛，特别邀请了国家蛋白质科学中心秦伟捷研究员，与赛默飞多位资 深讲师共同带来了创新质谱技术在蛋白组学、代谢组学、环境及材料等领域的最 新研究成果，并围绕该话题展开了热烈的交流。

秦伟捷

研究员 国家蛋白质科学中心（北京）

分享主题：

单细胞及血液蛋白质组研究进展

发展单细胞分辨的组学分析技术已经成为生命科学研究的热点和趋势。秦老师团队研发了一种基于微孔芯片的单细胞样本前处理技术，实现了对同一单细胞中代谢物和蛋白质的分步提取。血液是最主要的临床样本之一，基于质谱的血液蛋白质组学技术是发现生物标志物的有力方法。秦老师团队构建了基于纳米材料富集的血液蛋白质组研究新策略。基于 Orbitrap Exploris 480 平台，显著提高单细胞和血液蛋白质组覆盖深度，达到了 2000-3000 蛋白/细胞和血浆低 ng/L 级的鉴定灵敏度。

展台风采

学术大会期间，赛默飞展台人气异常火爆，吸引了大量参观者前来打卡。除了多款创新质谱和前沿解决方案亮相吸引大家眼球之外，赛默飞革命 Orbitrap 新品的国内首秀，以“颠覆认知 重塑可能”的创新突破，引爆现场，大家纷纷前来目睹新品真容风采，展台前挤满了人群。

随着新冠肺炎的疫情不断升温，3月17日，的生物技术公司Trans Chromosomics（TC）在官网（https://trans-chromo.wixsite.com/transchromosomics）发表一项声明，表示已经与美国Precision Antibody（PA）公司达成一项合作协议，共同研发应用于COVID-19的全人源的ZL性单克隆抗体药物。

　　日本TC公司创立于2014年，由转基因小鼠领域的学者MitsuoOshimura创建。1997年，时任日本Tottori 大学的分子与细胞遗传学部研究员的MitsuoOshimura博士与当时在日本麒麟啤酒公司（Kirin Brewery）任职的Isao Ishida博士合作，通过转染色体的方式，首次成功的建立了可以表达全人源抗体蛋白的转基因小鼠。1997年6月，这一成果发表在《自然遗传》（1）上，立刻引起轰动，被《纽约时报》和《华盛顿邮报》等多家媒体报道。用染色体片断做载体，日本研究团队把转基因的极限扩大了至少10倍。这种用新方法改造的小鼠被命名为TC小鼠，或转染色体小鼠。人的抗体库在小鼠的B细胞群里得到完整表达。

（图片源自TC公司官网）

拥有成熟的转染色体小鼠技术的日本TC公司，通过提供表达全人源抗体的转基因小鼠，与美国PA公司合作进行用于COVID-19的全人源的ZL性单克隆抗体药物研究，这是一场非常有意义的强强联合的国际合作。后者（PA公司）在抗体获取技术方面有长期的经验和成熟的技术，历年来与许多大型制药公司和国家卫生研究院（NIH）等公共组织合作取得成功。同时，TC公司还与日本国家传染病研究所（NIID）、Tottori 大学紧密合作，共同进行技术攻关，争取早日成功获得COVID-19 ZL性抗体药物。

据日本TC公司称，有许多公司致力于发现抗COVID-19的ZL药物，例如1）重新利用现有药物，2）发现疫苗，3）单克隆抗体。在现有的各种抗体捕获技术中，TC公司选择DNA免疫法以Z快的速度获得单克隆抗体。TC公司的ZD将是在COVID-19的包膜上表达的棘突蛋白（S蛋白），它是病毒进入人体的一个重要部分。

　　日本TC公司和美国PA公司都采购了NEPAGENE公司的设备，并将其用于过往、及现今紧锣密鼓进行中的COVID-19相关研究。他们配置了NEPA21全能型GX基因转染系统以及ECFG21细胞融合仪，NEPAGENE公司正为包括他们在内的客户提供全面周到的技术支持。希望我们的研究者，能早日找到防止COVID-19大流行和继续威胁人类生命的方法。

低调的分割线

　　NEPAGENE公司是世界知名的电转染和电融合设备研发及生产厂家。借助NEPA21zhuo越的基因导入功能，研究者可以便捷、GX地进行体外或活体的转基因操作，可用于生产基因组转基因动物，或用于帮助动物免疫，获得ZL性抗体。早在2015年发表在Vaccine的文献报道，应用NEPA21进行小鼠的肌肉电转来导入DNA疫苗用于研究登革热疫苗的研发，获得表达IgG2b或IgG3亚类抗体的小鼠。这项应用也可助力新型冠状病毒有关的疫苗或单克隆抗体研发【2】。

除此之外，在2017年，NEPA21应用在小鼠肌内或肿瘤部位进行DNA的体外电转，通过在MC38肿瘤模型小鼠中记性肌肉用于一些抗体基因的药代动力学的研究，实验证实，通过电转的方式瞬时性大大提高。

（文献中部分图示展示，3）

由于T细胞识别的人类疱疹病毒6B（HHV-6B）表位的鉴定可能有助于开发潜在的疫苗和免疫疗法。 2019年，有作者通过使用NEPA21体内电穿孔的方式，将编码BgQ1的质粒DNA转到小鼠肌肉中，在BALB / c小鼠中鉴定出的CD4 +和CD8 + T细胞表位可能是用于开发T细胞反应，诱导HHV-6B疫苗或免疫疗法的良好动物模型系统。【3】）

不仅在人类疱疹病毒方面，NEPA21还应用到了登革热病毒（DENV）疫苗的研究中，2019年，日本神户大学，发现编码由抗原和对DC内吞受体DEC205特异的单链Fv抗体（scFv）组成的融合蛋白的DNA疫苗，可诱导对目标抗原的强烈免疫反应。将产生编码与DENV2包膜蛋白结构域III（EDIII）融合的scFvαDEC205或同种型对照（scFv ISO）的质粒在免疫小鼠中评估EDIII特异性免疫，Z终发现，使用编码scFvαDEC205的DNA疫苗将DENV2 EDIII蛋白靶向DC可以改善抗体和CD4 + T细胞反应。该策略为使用编码针对DC抗原的DNA疫苗作为增加免疫原性的策略开辟了前景【4】。 

　　借助ECFG21的细胞融合功能，研究者可进行GX的脾细胞融合获得杂交瘤细胞，或进行卵母细胞激活获得体细胞克隆动物等。美国PA公司经过对比研究发现，对难获得阳性克隆的小分子抗原、多肽类抗原，使用ECFG21的融合效率甚至可达PEG的25~100 倍！

参考文献

(1) omizuka, K., Yoshida, H., Uejima, H. et al. Functional expression and germline atransmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice. Nat Genet 16, 133–143 (1997). https://doi.org/10.1038/ng0697-133

(2) Atsushi Yamanaka, PannamthipPitaksajjakul, PongramaRamasoota, EijiKonishi
Expression of Enhancing-Activity-Free Neutralizing Antibody Against Dengue Type 1 Virus in Plasmid-Inoculated Mice
Vaccine, 33 (45), 6070-7 2015 Nov 9

(3) Satoshi Nagamata, TaikiAoshi, Akiko Kawabata, Yoshiaki Yamagishi, Mitsuhiro Nishimura, SoichiroKuwabara, Kouki Murakami, Hideto Yamada, Yasuko Mori
Identification of CD4 and H-2K d-restricted Cytotoxic T Lymphocyte Epitopes on the Human Herpesvirus 6B Glycoprotein Q1 Protein
Sci Rep, 9 (1), 3911 2019 Mar 7

(4) Arthur BaruelZaneti,Dendritic Cell Targeting Using a DNA Vaccine Induces Specific Antibodies and CD4 + T Cells to the Dengue Virus Envelope Protein Domain III
Front Immunol, 10, 59 2019 Jan 29 eCollection 2019

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