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冷冻真空干燥的主要用途

1.1. 冻干技术在医YF面

生物制品:活性疫苗或血液制品，如:活菌苗--卡介苗，活毒疫苗一一狂犬疫苗。冻干人血浆是采取健康人血，加入抗凝剂经离心分离，取上清在-30℃下旋冻成固体，再经真空升华除去水份制成。

西药生产:以抗生素为主、维生素。

优点:

1) 药液在冻干前分装，方便、准确、可实现连续化;

2) 处理条件温和，在低温低压下干燥;可避免高温高压下的分解变性，蛋白质不会变性;

3) 含水量低，冻干产品含水量一-般在1%~3%。真空，可通N2保护，产品不易被氧化，有利于长途运输和长期保存;

4) 产品外观优良，为多孔疏松结构，颜色基本不变，复水性好能迅速吸水还原成冻干前状态;

5)冻干设备封闭操作洁净度高，减少杂菌和微粒的污染，缺氧的条件可起到灭菌和YZ细菌活力；

冻干制剂的生产过程包括

口  药液准备

口  预冻(冻结)

口  一次干燥(升华干燥)

口  二次干燥(解吸干燥)

口  密封保存

中药生产:人参、鹿耸、灵芝、三七等。

采用真空冷冻干燥对新鲜三七切片进行干燥，并通过与传统干燥技术热风干燥方法比较有效成分含量和品质差异。结果表明:真空冷冻干燥得到的三七切片成品人参皂苷Rg1含量显著高于热风干燥，为2.35%， 干燥后的三七切片成品表面黄白色、平滑无裂痕、质轻，药味浓，有良好的色泽及外观，热风干燥为1.06%。真空冷冻干燥与热风干燥后三七的品质有显著性差异。因此，真空冷冻干燥技术对三七传统药材干燥具有很好的效果。 

1.2.冻干技术在YL方面

利用冻干技术可以长期保存血液、动脉、骨骼、皮肤、角膜和神经组织等各种器官。因为在冻干时生物体细胞未被破坏，冻干后的生物体保存起来仍像原来那样具有生命力，如果再复水，生物体又复活。例如冻干骨骼、可使骨组织保持在固态，蛋白质变性最小，并保持酶的活性，可以贮存在室温或冰箱中长达2年，临床证明用冻干骨再植能复原为正常骨质生理特性，效果良好。 

1.3. 冻干技术在食品工业

已经采用冻干法加工的食品:

1、烹饪原料:肉、蛋、鱼、蔬菜等。

2、土特产品:蘑菇、黄花菜、香椿芽、苔菜以及各种山野菜等。

3、调味品:葱、蒜、姜、辅料、香料、香精、色素、汤汁等。

4、食品工业用的原料:奶粉、蛋粉、植物蛋白、茶叶、干果粉、肉粉、豆粉等。

5、饮料类:咖啡、菓珍等

7、水果类:香蕉、菠萝、草莓、桃、哈密瓜、苹果、梨等。

8、特殊食品:宇航、远洋、边防、野外作业、各种考察队用的食品。

正在用冻干法开发的食品: .

1、新型方便食品:冻干法生产的维生素、大豆粉、 花生粉等，以保证方便食品的营养成分。第二代方便食品是用冻干的海带粉、海藻胶、天然水果粉、鱼粉、兔肉粉、牛肉粉等制成的。

2、粉末蔬菜:蔬菜冻干后磨成粉末加入面粉制成面条、饼干、糕点、饮料、糖果、保存蔬菜营养、纤维质和风味、各种保健食品。

3、颗粒蔬菜:将油菜、菠菜、萝卜叶、芹菜、豌豆、胡萝卜、南瓜、雪里红等八种蔬菜混合。冻干成一种叫“素食颗粒”的制品、含丰富叶绿素、胡萝卜素、各种维生素、矿物质营养素等天然营养物质又有鲜美的味道。

1.4冷冻真空干燥的历史

它是一门古老的现代技术:诞生早。

1811年:诞生，用于生物体的脱水。

1813年:真空低温条件下，水容易汽化。

1909年:用于保存菌种、病毒和血清。

1911年:冻干比其他方法干燥活菌数高。

1935年:首次在真空冷冻干燥过程中采用主动加热的方法使升华干燥过程大为强化,干燥时间短，因而可用于生产。

1940年:冻干人血浆开始进入市场。

1942年:用于医药工业,第二次世界大战时，由于输血的需要，必须发展血液制品，同时抗生素的需要量也急剧增加，促使真空冷冻干燥技术开始用于医药工业中。

1943年:最原始的真空冷冻干燥食品的设备出现在丹麦。说它是现代技术因为它已加入现代高新技术领域的行列。人体各器官的保存和再植是现代医学研究的课题之一。营养保健食品是现代人们生活的追求。航天飞机用的超轻隔热陶瓷，是现代科学的热门话题之一。 低温超导材料等纳米级超细微粉材料的制备。

以上都需要真空冷冻干燥技术与设备。

 1.5 冷冻真空干燥在生物研制中的地位

上游:清洗、研磨、培养、发酵

中游:固液分离(离心、过滤、沉淀)、细胞破壁(超声、高压剪切、渗透压、表面活性剂和溶壁酶等)、蛋白质纯化(沉淀法、色谱分离法和超滤法等)

下游:干燥(真空干燥和冰冻干燥等)，产品的包装处理技术。

1.冻干的应用

干燥是保持物质不致腐败变质的方法之一。干燥的方法许多，如晒干、煮干、烘干、喷雾干燥和真空干燥等。但这些干燥方法都是在0℃以上或更高的温度下进行。干燥所得的产品，一般是体积缩小、质地变硬，有些物质发生了氧化，一些易挥发的成分大部分会损失掉，有些热敏性的物质，如蛋白质、维生素会发生变性。微生物会失去生物活力，干燥后的物质不易在水中溶解等，更谈不上外观或性能的恢复，因此干燥后的产品与干燥前相比在性状上有很大的差别。

冷冻干燥就是把含有大量水分的物质，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸汽直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变，疏松多孔。

冻干过程

1.1.冷冻干燥的特点∶

一．冷冻干燥在低温下进行，因此对于许多热敏性的物质特别适用。如蛋白质、微生物之类不会发生变性或失去生物活力。食品的营养成分和风味损失很少，可以ZD限度地保留原有的成分、味道、色泽和芳香。因此在医药、食品、植物学等方面得到广泛地应用。

二．在低温下干燥时，物质中的一些挥发性成分损失很小，适合一些化学产品，药品和食品干燥。

三．在冷冻干燥过程中，微生物的生长和酶的作用无法进行，因此能保持原来的性状。

四.由于在冻结的状态下进行干燥，因此体积几乎不变，保持了原来的结构，不会发生浓缩现象。

五．由于物料在升华脱水以前先经冻结，形成稳定的固体骨架，所以水分升华以后，固体骨架基本保持不变、干制品不失原有的固体结构，保持着原有形状，多孔结构的制品呈海绵状具有很理想的速溶性和快速复水性。

冻干后的产品结构

六.由于物料中水分在预冻以后以冰晶的形态存在，原来溶于水的无机盐之类的溶解物质被均匀分配在物料之中。升华时溶于水中的溶解物质就地析出，避免了一般干燥方法中因物料内部水分向表面迁移所携带的无机盐在表面析出而造成表面硬化。

七．由于干燥在真空下进行，氧气极少，因此一些易氧化的物质得到了保护，同时因低温缺氧能灭菌或YZ某些细菌的活动。

八.干燥能排除 95-99%以上的水份，使干燥后产品能长期保存而不致变质。因脱水彻底、重量轻、 适合长途运输和长期保存。在常温下采用真空包装保质期可达3—5年。冷冻干燥是保存生物特性敏感的组织及组织成份的ZJ方法。因此，冷冻干燥目前在医药工业，食品工业，科研和其他部门得到广泛的应用。

九．真空冷冻干燥的主要缺点是设备的投资和运转费用高，冻干过程长，产品成本高，但由于冻干后产品重量减轻运输费用减少了，能长期贮存，减少了物料变质损失，对某些农副产品深加工后减少了资源的浪费，提高了自身的价值。例如干血浆、干粉针剂。

真空冷冻干燥技术具备以下优点

(1) 对热敏性物质特别适用，因为冷冻干燥在低温下进行。如蛋白质、微生物之类不会发生变性或失去生物活力。

(2) 在低温干燥时，物质中的一些挥发性成分损失小，适合一些化学产品、药品和食品的干燥等。

(3) 在冷冻干燥过程中，微生物的生长和酶的作用无法进行。因此能保持原来的性状。

(4) 在冻结的状态后干燥机体几乎不变，保持了原来的结构。不会发生浓缩现象。

(5) 干燥后的物质疏松多孔，呈海绵状，加水后溶解速度完全，几乎立即恢复原状。

(6) 在真空条件下进行，氧气极少，因此一些易氧化的物质得到保护。

(7) 物质可长期保存不导致变质。

真空冷冻干燥技术食品的特点

在真空冷冻干燥过程下，果蔬中的水会迅速形成冰晶的形态，避免了果蔬内部水向其表面毛细流动迁移而导致可溶性物质和营养物流失。其不破坏组织结构，复水性极好，最大限度地保持原有的色、香、味。冷冻干燥后的果蔬可使一些热敏性或极易氧化氮的物质损失大大的减少，保存了物质中的维生素、蛋白质、碳水化合物等营养成分，在国外研究资料表明，保存1-2年的冷冻干燥食品的营养可以完全代替新鲜食品。在包装上，真空冷冻干燥食品均可采用真空包装或冲氮包装，避光保存。由于含水量很少，运输、销售时不用低温保藏，并且保存期限长。脱水彻底后，重量减轻，方便运输，可在常温下保管。是一种家用方便的食品。

在食品上的应用

20世纪50年代，食品冷冻干燥已从实验研究应用到小规模生产，随着技术的不断突破，又向规模工业化发展。近年人们越来越注重加工食品的方便、营养保健和高品质，因此对冻干食品的需求不断增加。几乎所有的食品原料，果蔬、肉禽、蛋等都可以进行真空冷冻干燥加工。

真空冷冻干燥的食品有以下几种类:

蔬菜类:葱、蒜、蘑菇、香菜、芦笋、胡萝卜、黄花菜、豌豆、洋葱等。

水果类:香蕉、苹果、草莓、哈密瓜、菠萝等。

肉禽类:猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉等。

健类:人参、鹿茸、蜂王浆、蜂蜜、花粉、蟹粉等。

食品冷冻干燥技术的发展趋势

进入21世纪以后，随着人们环保意识、健康意识的不断增强，生活节奏的不断加快，人们对科学加工的食品产生了更高的认识、提出了更多的要求，这将大大推动食品真空冷冻干燥技术的进一步发展。

关于四环

四环福瑞科仪科技发展（北京）有限公司法人由原北京四环科学仪器厂有 限公司技术研发和管理负责人担任，是为客户提供专业真空冷冻干燥设备及解 决方案的服务供应商。我们秉承“以客户为中心，追求最高的客户满意度"的 服务理念，个性服务、创新设计、高效处理、可靠保障，可根据用户需求提供 和设计单个或多个符合 GMP 相关标准的冻干设备配套系统，如负压和无菌隔 离器、自动进出料及外置 CIP 等系统。
我们以共赢发展为本，技术服务为根，在臻于完善中与众不同。

#01 退火工艺参数的设计：

依据预冻过程和退火的原理可知，退火涉及三个关键工艺参数:退火温度，退火维持时间，退火后降温时间。

根据热力学原理，退火温度应高于最大浓缩液玻璃化转变温度(temperature of vitreoustransformation) Tg’，因为只有高于此温度时，已固化的非晶相才会回复成溶液状态，促进非晶态溶液中的水和其他物质重新结晶。有的文献认为应小于或等于共熔温度，因为在此温度才更有利于重结晶，而有的重结晶现象可以直接在热分析图谱中直接看到。因此DSC热分析是研究退火条件的重要手段。

甘露醇/蛋白溶液DSC分析曲线

退火维持时间，应该由溶质的结晶性质，退火的温度和装载高度等诸多因素决定，因此目前还没有合适的数学模型。

#02 退火的意义：

退火能够促进结晶增长，扩大升华孔道，减小升华阻力，缩短冻干时间，并且容易获得优雅的外观。有实验研究表明，2%甘露醇冻干后的横截面，在-3℃退火4小时后，孔径由原来90μm变成了120m孔，初次干燥时间由1030min减小到790min。(以下两组照片能明显看出不同预冻速率冻干后粉饼区别)

初次冻结过程由于成核温度的差异产生不同的晶粒形态和大小，从而使升华干燥不均匀，退火过程中的重结晶可减小这种差异，使产品更加均一。

退火过程能够释放出非晶态中可结晶物，提高非晶相Tg’，如甘氨酸和蔗糖(1:1）配方在-20°℃下退火，可使甘氨酸结晶析出，产品的Tg’由-44℃升高至-33℃，而且充足的结晶性骨架可以保证粉饼即使在高于Tg’的温度进行初次干燥，依然能维持良好的外观，这样就能大大提高允许的干燥温度，缩短冻干周期。

退火过程能够释放出非晶态中的水分，使其重结晶，而使解析干燥变得容易。同时使冻干粉Tg升高，从而提高稳定性。但是需要注意的是，退火过程会造成冷冻浓缩液相分离，浓缩液中蛋白质在固液界面处可能发生变性。

总结

应用QbD的理念，在设计冻干工艺过程中，预冻阶段是否退火及退火工艺参数的是必须要考虑的内容，可以通过溶质的性质，装填体积等信息及DSC热分析，电镜扫描等检测结果进行综合考虑。一个经过良好设计的退火工艺不仅能大大缩短冻干周期，而且能够提高冻干粉的稳定性。

四环冻干机

四环福瑞科仪科技发展（北京）有限公司法人由原北京四环科学仪器厂有 限公司技术研发和管理负责人担任，是为客户提供专业真空冷冻干燥设备及解 决方案的服务供应商。我们秉承“以客户为中心，追求最高的客户满意度”的 服务理念，个性服务、创新设计、高效处理、可靠保障，可根据用户需求提供 和设计单个或多个符合 GMP 相关标准的冻干设备配套系统，如负压和无菌隔 离器、自动进出料及外置 CIP 等系统。 

我们以共赢发展为本，技术服务为根，在臻于完善中与众不同，在持续发 展中追求卓越。

在环保行业需要对水质、土壤、生物质进行调研监测，保证其数据的准确性和真实性非常的关键。数据的准确性和真实性由两个方面决定：一是分析仪器的分辨率和可重现性，二是样品前处理是否能够达到分析仪器的进样标准。这两个方面都很重要。在样品前处理方面，要确保样品的含水量和纯度，冻干法在样品前处理脱水方面显示出了极大的优越性。

1、真空环境下，升华干燥。对制品的化学性质、物理性质及活性无影响。

2、样品含水率低，一般低于5%，ZD可达到0.01%。

3、对于土壤类冻干后，酥脆，便于研磨。

4、干燥效率高，是真空干燥、模拟自然风干燥、晾干及烘干效率的几倍。

5、上样量大，一台专业型设备一天可制备上百个土壤样本，一台设备即可满足样本前处理的需要。

6、避免交叉污染，可完全避免不同批次及同批次的交叉污染。

7、方便快捷，对于半挥发性有机物检测，专用的土壤冻干瓶即可用于采用，也可用于冻干，还可以用来封存样本。

土壤的微观结构测试需要干燥后的样品，传统的干燥方法：风干法、烘干法等。这些方法都存在使土壤样品体积收缩、改变土微结构状态的缺陷，粘性土随着含水率的减少， 其微结构也会发生变化， 体积缩小。常规的风干法和烘干法易使土的微结构发生较大的变化，无法满足微结构研究的测试精度。而采用四环土壤冻干机对样品进行真空冷冻干燥，不产生体积膨胀保证脱水后土样的微观结构不发生变化。

土壤冻干法步骤:

设备：四环福瑞LGJ-80D土壤冻干机     样本：土壤

1.样本准备，将采集的土壤样本收集到密闭的非金属容器;

2.根据样品分隔要求,将土壤样本放置物料盘内;

3..放入冻干机内，开始制冷,在低温下进行预冻;

4.预冻结束后，执行干燥程序;可直接调用内嵌干燥程序;

5.干燥结束后收集冻干机土壤样本，保存需真空密封;

6.停机，化霜清洁。

四环福瑞LGJ-80D土壤冻干机技术参数：

● 达标冷阱温度： ≤ -70℃ （空载，环境温度 ≤ 30℃）

● 极限冷阱温度： ≤ -75℃ （空载，环境温度 ≤ 25℃）

● 达标预冻室温度： ≤ -55℃ （空载，环境温度 ≤ 30℃）

● 极限预冻室温度： ≤ -61℃ （空载，环境温度 ≤ 25℃）

● 达标真空度： ≤ 5Pa（空载）

● 极限真空度： ≤ 1Pa（空载）

● 预冻室降温速率：20℃降至 -40℃≤ 60min（空载）

● 冷阱降温速率：20℃降至 -40℃≤ 20min（空载）

● 真空抽气速率：标准大气压降至 10Pa ≤ 15min（空载）

● 搁板控温范围：-40℃～ +70℃ （LGJ-35C/50C/80C 除外）

● 电源要求：AC380V 50Hz 三相五线制 或 AC220V 50Hz

● 总功率：4000W

● 适用环境：≤ 30℃

5.5.3 冻结角膜的干燥过程

角膜干燥前，先开启制冷机，分别对冻干室、捕集器制冷，当冻干室内温度降到-20℃以下，捕集器内的温度降到-35℃时，迅速地把经过梯度降温的角膜放到冻干室，立即启动真空泵。在干燥过程中根据需要，调节充气阀，向冻干室内充入氯气以调节冻干室内的压力，同时根据需要调节制冷阀保证角膜冻干过程中所需要的热量供给，在干燥初期，不需开启加热器，此阶段角膜干燥所需要的热量靠外部传入即可得到满足，当冻干室内温度达到0℃时，开启加热器供给热量，但保证冻干室的温度不超过9℃，冻干结束，关闭真空泵，对冻干角膜进行充氮包装。实验中发现，角膜在磨口玻璃瓶中的放置方式（图5-14）对冻干角膜质量有一定的影响，试验表明，角膜悬于磨口玻璃瓶中，内皮细胞层朝下为最佳放置方式。如图5-14(b)所示。

角膜冻干过程热量的供给很容易满足，整个冻干过程可以视为传质控制过程，传质速率由细胞膜固有通导能力决定。干燥过程中，应根据干燥的不同程度，来确定冻干室内压力的高低以及所持续的时间，保证水蒸气由细胞膜孔隙溢出，且细胞膜内外压差始终很小，以减小对细胞的伤害。

由于角膜细胞很脆弱，在冻干过程中极易受到干燥应力、机械应力的损伤，冻干过程中低压时间过长或细胞膜内外压差过大，都会大大降低冻干角膜的成活率。变幅值、变周期的循环压力法应用于角膜的冻干，有利于角膜活性的提高。其根本原因是在整个干燥过程中，角膜细胞内外压差小，对角膜的损伤小。这主要源于两方面原因：一是通过控制冻干室内真空度的高低，以及循环时间的长短，使细胞内的蒸汽及时扩散到冻干室中，避免了细胞内饱和蒸气压过高，膜内外压差过大，造成细胞的损伤。当细胞内蒸气压较高时，开启充气阀向冻干室内充入氮气，在细胞膜外施加一压力，虽然此时传入细胞内的热量增多，使细胞内的蒸气压进一步升高，但此蒸气压的升高较细胞膜外压力的升高小得多，结果是细胞膜内外的净压差减小。然后，渐渐关闭充气阀，使冻于室内的真空度逐渐升高，这样角膜细胞内的蒸汽较平缓的通过细胞膜扩散到冻干室，减小了压差对细胞膜的损伤。当冻干室内真空度升高到一定程度，再逐渐充入氨气，传人的热量增多，开始了下一个周期。二是强化传热并促进外部传质，缩短冻干时间，从而减少了角膜内皮细胞受干燥应力损伤程度，具体工艺是读干室内温度到-25℃，真空度为50Pa时，开始第-次循环，温度每升高5℃循环一次，循环5个周期，温度达到0℃时，循环停止。压力时间关系曲线见图5-15，角腹的冻干工艺曲线如图5-16所示。

图5-17、图5-18分别为按上述工艺冻干角膜透射电镜检测结果、扫描电镜检测结果。从图5-17、图5-18可以看出，冻干角膜的内皮细胞间连接紧密，细胞轮廓接近于六边形。

细胞膜完整，细胞核膜完整，内皮细胞层与后弹力层连接紧密。这是因为整个冻干过程中，根据干燥的不同程度，来确定高室压、低室压以及所持续的时间，保证了水蒸气由细胞膜的孔隙溢出，即传质速率由细胞膜的固有通导能力决定，保证了细胞内外压差始终很小，减小了对细胞的伤害。

5.4.2 动物角膜的冻干

理想的角膜保存方法要满足技术简单、最大限度地保持角膜组织的活性、保持生理状态下角膜厚度和结构、有利于手术操作等要求。现有的角膜保存技术中，除了最有代表性的4℃湿房短期保存法外，还有受者血清保存法、器官培养保存法、甘油冷冻保存法、深低温冷冻保存法和无水氯化钙干燥保存法，这些方法都没能满足上述理想保存方法的要求。角膜冷冻真空干燥的目的是保持其活性，便于较长时间的贮存，使需求者能及时得到活性角膜，以便再植。

 5.5.1 角膜的冻干工艺流程                  

冻干角膜保持活性的关键是冻干工艺，角膜的冻干工艺是一个复杂的过程，如图5-12所示。影响冻干效果的因素很多，如保护剂的配制、角膜的冷平衡、梯度降温、冻干室内压力变化、温度变化，冻干角膜复水等。东北大学的王德喜对角膜的冻干进行了系列研究。研究中使用的是中国医科大学临床医院动物室提供的大耳白家兔，体重为2～3kg。

 5.5.2 角膜冻结过程中的冷平衡            

角膜在梯度降温过程中，要经受-150℃以下的低温损伤，在干燥过程中，要经受干燥应力的损伤，在没有保护剂保护情况下，经历如此损伤，角膜细胞很难保持活性。合理的选择和配制保护剂对角膜的保存至关重要。实验研究表明角膜由蔗糖、二甲基亚砜(DMSO)、20%安普莱士（人血白蛋白）作为保护剂，冻干效果良好。

为了防止角膜在冻结过程中损伤，还要对角膜进行冷平衡处理。冷平衡保护剂的具体配比见表5-12。具体操作过程：将无菌的角膜片先放入1号液，移入4℃冰箱冷平衡10min，然后用无菌镊子夹住巩膜边，将其移人2号液平衡10min，依次在3号液、4号液中各平衡10min。冷平衡工艺如图5-13所示。在冷平衡过程中，保护剂中的DMSO通过角膜的细胞膜进入到细胞中，置换出其中部分水分，在达到动态平衡前，保护剂中DMSO浓度要高于细胞中DMSO浓度。角膜依次在不同浓度的保护剂中进行冷平衡，这样角膜中的水分就会不停地与保护剂中的DMSO进行置换，经过一段时间的传质，细胞中的水分将大量减少。由于细胞内水分溢出速度与DMSO的浓度有关，为防止细胞内水分溢出速度过快造成细胞的损伤，使角膜细胞有个适应过程，角膜冷平衡采取逐步递增DMSO浓度进行平衡。冷平衡处理后兔角膜内皮细胞经联合染色检测，结果与新鲜角膜无区别，说明冷平衡对角膜内皮细胞的活性无损伤，该冷平衡工艺可行。

待角膜在4号液平衡结束后，立即取出放入磨口玻璃瓶里，在降温仪中进行梯度降温。梯度降温目的是使细胞内的溶液冻结成玻璃态，以使角膜迅速越过对细胞冻伤最严重温度区（-30～-60℃）时，细胞不受伤害。采用两步法进行梯度降温，第一步角膜距液氮面9cm，停留l0min，使角膜内部温度稳定在-16～-20℃范围内，此阶段角膜的降温速率为2～2.4℃/min;第二步角膜距液氮面1.5cm，停留10min，使角膜内部温度稳定在-130～-150℃范围内，此阶段角膜的降温速率为11～14℃/min。慢速降温时，细胞外的水易冻结成冰，电解质浓度升高，细胞内的水渗出细胞外，使细胞暴露在高浓度的溶质中，导致细胞膜蛋白复合体的破坏和膜的分解，造成溶质损伤。快速降温时，细胞内的水来不及渗出便结成冰，细胞内外同时有冰晶形成，容易刺破细胞造成机械损伤。这样必须快速慢速相结合，方可达到目的。由于冷平衡时，二甲基亚砜已经将细胞内的水分多数置换出去，在缓慢降温时，细胞内的溶质易形成玻璃态，可以避免溶质损伤。故可以先慢速降温，然后快速降温。两步法降温中，第一步慢速冷冻，将角膜温度慢速降至-20℃，可以避免过快冷冻时角膜内冰晶形成所造成的损伤和过慢冷冻时细胞置于高浓度溶液下时间过长所造成的溶液损伤。第二步快速冷冻，角膜以很快的降温速率降至-130℃以下，细胞内未冻溶液实现了非晶态固化，使细胞少受或不受损伤。

5.4 骨骼和骨 髓干细胞的冻干

       骨病和创伤引起的骨缺损或功能障碍是危害人类健康的主要原因之一。骨组织工程的提出、建立和发展为从根本上解决骨缺损的修复、结构以及功能重建提供了新的途径，但目前的组织工程骨构建需要较长的时间且保存条件苛刻，不能达到“随取随用”的最终要求。1942年古巴医生Inclan提出骨库概念，1950年美国首先在马里兰州建立海军组织库。骨库的建立使临床异体骨移植成为可能。

      5.4.1 冻干骨的生物性能                    

      早期保存异体骨的方法主要是冷冻和冻干处理，而冻干骨更被看好，来源包括肋骨、髂骨、下颌骨。这一点在后来Malinin等的动物实验得到了证实。他们以9只狒狒为实验对象，将冷冻骨与冻干骨分别植于动物胫骨近端对称部位并做了组织学观察，结果发现冻干骨不仅可以诱导成骨，且成骨速度优于冷冻骨。Sewell等分别在猴子下颌骨下缘两侧造成17mm×5mm的缺损，结果一侧接受异体冻干骨移植的6只猴子其下颌骨块处均获得愈合。Pike和Boyne采用大段冻干骨和自体骨 髓复合进行了狗和猴子下颌骨重建，证明异体冻干骨易于被宿主接受，但是6例实验中有2例与口腔穿通将自体骨冻干后植入狗的节段性骨缺损获得了成功，结果经统计学分析显示自体骨冻干前后的孔隙率、植入骨与宿主骨的愈合时间、新骨骨痂形成量、成骨后的力学强度等均无显著差异。

       1990年后，大段同种冻干异体骨移植研究继续发展，国内外众多学者分别进行了冷冻骨移植的临床实践，但整体来说大段异体骨移植还面临动物实验过少、临床工作不系统的问题，目前自体骨移植在矫形外科依然占据绝对主导地位。同时，随着骨库的蓬勃发展，以Stevenson、Enneking等为代表的一批学者做了大量基础和临床研究，大段同种异体骨移植在骨科得到了广泛和成功的应用。1993年Ellis等采用冻干异体骨结合自体松质骨进行了10例下颌骨重建，随访3.5年8例获得成功，2人出现并发症经过手术处理恢复良好。

         通过对西南医院数百例冻干异体脱钙骨基质(FDBM)使用患者的随访观察，使用冷冻和冻干处理三个月以上的异体骨降低了原本的免疫活性，虽有抗原残留但可以忽略其不良作用。自1965年Urist率先研究同种异体冻干骨的成骨功能以来，冻干脱钙骨基质(FDBM)在临床应用逐渐广泛。FDBM有良好的孔隙率及孔隙间连通率，同时还保留了一定的骨诱导能力，其表面拥有矿物沉淀的位点，能与启动和控制矿化的非胶原基质蛋白结合，因此还能促进矿物质的沉淀，促进骨生成。FDBM是应用特殊工艺制备的生物骨替代材料，由于精细的骨小梁结构和内部孔隙被保存下来，同传统骨替代材料羟基磷灰石等相比具有较好的生物活性，近年被引入国内并很快应用于种植外科。Iwata等总结了FDBM的优点：保留部分骨诱导成分，能常温贮存而基本不变质，可快速降解并被宿主骨替代，能长距离发挥骨传导作用。

       我国解放军总医院口腔颌面外科许亦权等的研究表明，冷冻干燥骨具有骨抗原性更低、保存条件宽松的优点，是骨库另一常用异体骨保存方法。但有人提出冷冻干燥处理将异体骨中的水分在短时间内降低到6%以下，造成骨胶原纤维发生微小裂隙，因此可以导致力学性能降低，也有人认为使用之前充分水化可以改善这一缺点。目前冷冻干燥法较多用于处理松质骨块，四肢大段承重部位骨不进行冷冻干燥处理，关于皮质骨接受冷冻干燥处理后力学性能特点的报道较少。许亦权的研究中采用的冷冻干燥骨试件测试前经过了6h水化，结果发现：与新鲜组相比，冷冻干燥组在抗压缩测试中最大载荷、最大位移降低，刚度升高，但是配对检验均无显著性意义，方差分析最大位移显著降低；在抗弯曲测试中冷冻干燥组的最大载荷降低30%，刚度升高41%，统计学差异显著。这一结果与冷冻组表现出的特点相似，统计结果也显示冷冻干燥组与冷冻组相比最大载荷、最大位移和刚度均无显著性差异。这说明经过冷冻干燥处理的犬下颌骨硬而脆，抗弯曲能力下降比抗压缩能力下降明显。像冷冻组一样，经过水化的冷冻干燥犬下颌骨仍然可以保持良好的外形并能提供较好的支持能力。

        侯天勇进行了冻干组织工程骨(FTEB)与组织工程骨(TEB)活性比较研究。取志愿者捐献的骨 髓和骨组织分别培养(hBMSCs)和制备脱钙骨基质(DBM)，取第3代hBMSCs与DBM复合构建TEB，分别于体外孵育3d、5d、7d、9d、12d、15d经过低温干燥后得到冻干组织工程骨。将FTEB、TEB和DBM分别移植于30只6周龄BALB/C裸鼠皮下进行异位成骨实验。移植术后4周各种移植物未见明显钙化；术后8周、12周，TEB和FTEB移植裸鼠皮下可以实现较好的异位成骨。通过X线片评分、CT值比较移植物钙化程度，TEB和FTEB差异无统计学意义，而DBM未见明显钙化。HE染色显示TEB和FTEB出现钙化，DBM降解吸收。可见，FTEB与TEB具有相似的成骨活性。

5.3.2  大鼠皮肤吹干与冻干比较研究

10年后，西北大学的杨维也进行了大鼠皮肤的冷冻干燥实验。他首先重点研究了浓度、孵育时间、孵育温度对大鼠皮肤冻干保护剂海藻糖负载量的影响。实验结果表明，大鼠皮肤对海藻糖的载入量的优化条件为：海藻糖浓度800mmo1/L,孵育温度37℃，孵育时间为7h。之后，皮肤组织分别进行冻干和吹干。

(1)冻干  皮肤组织在37℃加载海藻糖，4℃加载DMSO，将负载了海藻糖和DMS0的皮肤块放入冻存管内，冻存管放入程序冻存盒，置于-80℃冰箱冷冻。12h后将冷冻的皮肤组织连同冻存管转入预冷的冻干机，去掉冻存管盖子。冷冻干燥机运行状态参数为：冷阱中温度-45℃，冷阱上方温度0℃左右，真空度10Pa,冻干时间设置30h。先将皮肤样品置于冷阱中冻干24h，然后在冷阱上方冻干6h。先在冷阱中冻干是为了防止皮肤组织中固态的水分回融再结晶对组织产生冰晶损伤，组织中大部分游离水升华后转冷阱上方冻干，此时温度稍高可以进一步除去组织内部水分。

(2)吹干  皮肤组织在37℃、800mmol/L海藻糖培养液中孵育7h加载海藻糖，负载了海藻糖的皮肤用滤纸拭去表面残留液体，表皮朝下平展于玻璃培养皿中，培养皿敞口置于生物安全柜（打开送风开关）吹干。大鼠皮肤的吹干时间设置为20～30h可以将皮肤中水分去除较彻底，玻璃化状态良好。

经检测得知，刚冻干皮肤活性比刚吹干皮肤活性高1/3，保存时间延长到28d，冻干组皮肤活性与刚吹干组相当。冻干过程中，皮肤组织内水分先在DMSO保护下逐渐冻结，放入冻干机后固态水升华，由于海藻糖取代水分子的作用，干燥过程组织形态结构和活性不会发生变化，但在吹干过程中皮肤组织内水分由液态直接蒸发，原来包绕在细胞外的水膜以及和蛋白质等生物大分子结合的水分子可能还未完全被海藻糖取代就已蒸发。上述原因可能导致未保存的冻干皮肤活性高于吹干皮肤。干燥保存的皮肤活性开始降低速率较快，降到一定程度后降低速率减慢，所以保存一周后冻干组和吹干组皮肤活性没有统计学差异。

干燥保存的皮肤置于饱和湿度的恒温培养箱37℃预水化15min后，皮肤依次用含800mmol/L和400mmol/L海藻糖的DMEM培养液室温下孵育15min，用不含海藻糖的无血清DMEM培养液漂洗3次以上，清除皮肤组织中残留的DMSO和海藻糖，最后转入无海藻糖的DMEM培养液中孵育2h，进行形态观察。如图5-10所示。

冻干皮肤玻璃化状态良好，呈半透明状。复水后能够恢复到新鲜皮肤的大小和色泽。冻干皮肤角质层局部受损，而组织结构和细胞形态与新鲜皮肤组织没有差异。将冻干后复水的皮肤移植回自体大鼠，可存活13d。

自体移植后冻干组皮肤存活时间较吹干组长，可能是由于吹干过程对皮肤组织产生的损伤较大。冻干组皮肤在6d皮下出现血红色区域可能是自体动物在移植皮下发生血管化，但后来有两处变成暗红色，而其他区域血红色减弱消失可能是血管化失败，而吹干组未出现血红色，可能根本就没有发生血管化。

通过HE染色和透射电镜对比分析新鲜皮肤和干燥皮肤组织结构和细胞结构。HE染色结果显示干燥保存过程没有明显改变皮肤组织结构，也未影响皮肤组织的结构完整性。透射电镜结果说明干燥皮肤具有与新鲜皮肤无差别的细胞结构和胞外胶原结构，同时可观察到干燥皮肤细胞中结构正常的线粒体和平滑的核膜等细胞器。结构学观察结果证明干燥保存未对皮肤组织结构和细胞结构产生明显影响。

通过荧光标记和MTT活性分析研究干燥过程对皮肤活性影响。荧光标记结果表明，除毛囊处明显受损外冻干皮肤组织大部分区域在水化后能恢复活性。MTT活性分析结果显示冻干和吹干皮肤仍能分别保持58%和48%的活性。

5.3皮肤的冻干   

冻干皮肤在医学上的临床应用研究始于20世纪50年代。动物皮肤的冻干目的是用于对药物经皮肤渗透性的研究。由于透皮吸收给药新型的问世，药物经皮渗透性的研究正成为开发这类新型筛选药物的重要手段，由于大量长时间动物皮的需求，实际应用时常将待用皮放在冰箱里，可保存1周左右。时间再长，不但影响药理实验的稳定性，而且皮肤将变质。为增长皮肤保存期，可将动物皮肤冻干保存；人类皮肤冻干的目的是用于再植，为烧伤或外伤皮肤的病人植皮。

5.3.1 大鼠皮肤冻干工艺及药物渗透性实验

东北大学的郑文利博士早在20世纪末就进行了大鼠皮肤冻干的实验研究。取活大鼠脱颈处死后，立即用电动去毛刀去其腹部鼠毛，剥离皮肤，除去皮下脂肪层、血管及残留物，用蒸馏水冲洗干净，制成不同尺寸的皮片，再用生理盐水冲洗数次备用。将制备好的大鼠皮放在速率降温仪中，以-5℃/min、-l5℃/min、-30℃/min三种不同速率降温至-30℃。将三种不同降温速率预冻的大鼠皮，分别放入小型冻干机中抽真空，30min后压力稳定在120Pa,不主动加热，连续干燥34h后关机，充氮气后取出，用无菌塑料袋封装后，放在干燥器内保存。

将以不同预冻速率冻干的大鼠皮肤，经10%福尔固定，石蜡包埋制片，进行病理切片，切片厚度4～5μm,HE染色，再显微镜观察。新鲜大鼠皮组织切片如图5-8所示，以5℃/min速率预冻并冻干大鼠皮组织切片如图5-9所示。从图中可以看出冻干皮组织与新鲜皮组织相本相同，未见细胞破裂、上皮脱离、组织褶皱、细胞变性和细胞间隙增宽等异常，说明冻干皮组织结构未发生变化。其他速率预冻并冻干后的结果基本一致。

冻干大鼠皮角质细胞间隙脂流动性的电子自旋共振(ESR)测定：选  用5-噁唑氮氧自由基硬质酸(5-DSA)作为自旋转标记物，将新鲜的和  三种不同预冻速率的冻干大鼠皮角质层样品泡在浓度为1×10-4mol/L  的5-DSA缓冲液(pH=7.4)中12h，保温20℃，然后取出淋洗干净，37℃烘箱干燥1h，分别放进电子自旋共振波谱仪样品管内，再置于腔中。ESR测定条件：扫描宽度200G，接收增益3.2×104，时间常数20.48ms，微波功率5.02mW，扫描时间83.888s，调制频率  25.000kHz，调制幅度0.947G。经ESR波谱分析得知，三种不同冻  结速率预冻的冻干大鼠皮与新鲜大鼠皮各系数相比无显著差异，说明  冻干大鼠皮肤未引起表皮细胞间脂质结构的变化，大鼠表皮角质细胞  间脂质排列的有序性没有改变，流动性没有增加。

实验采用尼莫地平为模型药物（一种脑血管扩张药），选用预冻速  率为l5℃/min的冻干大鼠皮和新鲜大鼠皮做药物渗透性实验，考察其  组织结构有无变化。实验采用装置为V-lia-chien水平扩散池。它是由  两个等容积的玻璃半池组成，半池内径为l.35cm，有效扩散面积为  1.43cm2，容积为10mL。半池上方开口为取样口，池底有凹陷平  台，起到固定搅拌的作用。实验时将皮肤固定在扩散池的两个半池之  间，角质层面向供体池。水化1h后，供体池加入10mL尼莫地平的  30%丙二醇水过饱和溶液，接受池中加入10mL的30%丙二醇水，置  于32℃温水浴中，磁力搅拌，定时取样并更换全部接收介质。样品经  徽孔滤膜(0.45nm)过滤，续滤液，样品进人高效液相测定。尼莫地平  外含量测定采用高效液相色谱法紫外检测。色谱条件：色谱柱  Spherisorb46mm×25cm，检测波长237nm，流动相是甲醇/水  (64/36)，流速为1.1mL/min，进样量10μL。实验结果如表5-11所  示。

表5-11正常皮肤和冻干皮肤对尼莫地平渗透量比较

表5-11中的数据表明，在渗透9、10h、12h时，冻干皮肤与正常皮肤对药物尼莫地的渗透量无显若性差异。可见，冻干的大鼠皮肤能够满足药理的实验要求，可用做透皮制的实验研究，可以长期贮存备用。

5.2.6 猪丹毒疫苗冻干 

猪丹毒疫苗主要用于生猪生产中防疫。早在20世纪50年代，就有兽医药企业对猪丹毒疫苗的冻干进行了生产试验，给出了冻干工艺。之后又不断对猪丹毒疫苗的冻干工艺进行改进。南京兽医生物药品厂在70年代给出的冻干工艺为：-35℃开始升华，1.5h升至35℃保持14.5h，20mL瓶装7.5mL，干后菌存活率高达89.8%。制品共融点在-12℃左右，升华干燥7h后结束，疫苗温度约-12℃。苗内大部分水分在-10℃以下排除。14h后苗温和箱温接近一致，冻干曲线如图5-5所示。升华干燥期间，苗温与箱温有很大温差（约55℃），是制品在低温升华过程中排除大量的汽化热所致。解析干燥期间，供热主要用于排除菌苗中所含的少量水分，这一阶段供应相当多的热量，仅能排除有限的水分，是因为细胞内水分比细胞间的水分较难排除。研究表明，供热速度和温度的适应比装量多少、升华时间的长短具有更重要的意义。

5.2.7 猫泛白细胞减少症疫苗和“犬四联”弱毒疫苗冻干 

猫泛白细胞减少症是猫细小病毒引起的猫的一种急性、致死性传染病，乳发病猫死亡率最高，目前尚无治疗药物，需靠疫苗预防。李六金等研究了冻干猫泛白细胞减少症弱毒疫苗的冻干工艺。将疫苗按表5-9配方配制，经100℃恒温处理10min, 冷却到4～8℃，分装1mL/瓶，然后进行冻干。冻干工艺如图5-6所示。

通过上述工艺制备的猫泛白细胞减少症弱毒疫苗产品，为乳白色海绵状疏松团块，易于脱壁，残余含水量为3.0%～3.2%。加稀释液后迅速溶解，溶解后呈淡粉红色液体。经检测对比，冻干前后配苗毒液效价大致相同。肌肉注射给小白鼠和幼猫进行安全检验，结果被试动物全部键活。

冻干技术也可以用作混合疫苗的制备。李六金等还研究了“犬四联”弱毒疫苗的冻干。犬四联疫苗的配制按表5-10配方完成。

毒液配制好后，与稳定剂按1：1比例混合并分装成2mL/瓶。分装后的疫苗在LGJ型医用冷冻干燥机中冻干。

产品进箱后让冻干箱降温慢冻。预冻的最低温度-40℃，到达预定的-40℃后再保持1.5h。预冻结束减压，并在30min左右使真空度达到l0Pa，直至冻干结束为止。当真空度达到10Pa之后开始加热。总的冻干时间为20h。冻干曲线见图5-7。

冻干后的犬四联疫苗产品呈微黄白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离。加稀释液后迅速溶解成粉红色澄清液体。经检测，冻干后疫苗效价滴度比冻干前降低约0.5～1.0个滴度，属于正常范围。

5.2.8  甲型肝炎减毒活疫苗冻干 

液体剂型的甲型肝炎减毒活疫苗在市场上已经应用多年，并取得了较好的免疫保护效果，但疫苗需低温冻结保存，冷链运输。冻干的甲肝减毒疫苗，可方便于储运和使用。李光谱等研究了甲型肝炎减毒活疫苗的冻干。甲型肝炎病毒L-A-1株第23代，在人胚肺二倍体细胞ZBS株上大量培养后，分别制成纯化苗（经冻融、高速离心、PEG6000浓缩、氯仿抽提、Sephacryl S-400柱色谱等提纯，PBS缓冲液稀释，加适宜保护剂制成冻干疫苗)和未纯化苗（经冻融、超声、过滤等，加适宜保护剂制成冻干疫苗）。疫苗在ALPHA1-6冻干机中冻干。-50℃预冻，-50～30℃抽真空干燥6h，-30～-20℃抽真空干燥9h，-20～-5℃抽真空干燥5h，-5～28℃抽真空干燥10h。

甲型肝炎病毒属小RNA病毒，无脂蛋白包膜，一般不耐受冷冻干燥，解决无脂蛋白病毒冷冻干燥的问题需加入冻干保护剂。从实验结果看出，不同保护剂配方对冻干甲型肝炎减毒活疫苗冻干前后的病毒滴度影响较大，以山梨醇、蔗糖、脂肪酸盐(3%山梨醇、2%蔗糖、1%脂肪酸盐)配方为主的保护剂，保护效果好，冻干前后疫苗病毒滴度下降均在1.0以内，放置37℃ 1周下降0.5以内，符合规程要求。

未纯化疫苗中可能含有各种破坏性的酶（蛋白酶、脂肪酶等），冻干后37℃放置1周可能有一部分酶被激活，对病毒外壳结构和核酸RNA有破坏作用，纯化后无酶的影响，热稳定性较好。

5.2.3 冰核菌种冻干 

20世纪90年代初，朱红等发表了冰核菌种冻干的研究。冰核细菌大量附生于植物表面，并在-2～-5℃以下具有很强的冰核作用，在人工降雨降雪、人工制冰和生物免疫学检测方法中有很高的应用价值。朱红等人对冰核菌种的5种保存方法进行了比较研究。其中IHM4菌株的实验结果列于表5-6。

表5-6数据表明，对于IHM4冰核菌种，考虑存活力和冰核活力两个因素，冷冻干燥保存与灭菌水保存效果相当。但冻干后更方便储运，而灭菌水保存更为经济。该项研究没有给出具体的冻干工艺参数。

5.2.4 鼠疫菌种冻干 

为长期有效保存鼠疫菌种，使其不失原有的生物学特性，郑星铭等早在1997年就进行了鼠疫菌种的冻干研究，给出冻干工艺。活化的菌种接种于溶血赫氏琼脂斜面，28℃培养40h。将培养后的菌种研磨分散于1.5mL灭菌脱脂牛乳中，再分装在10支安甑中，每支约0.2mL、3~4mm高。为确保鼠疫菌种不被抽出，防止污染环境，每支安瓿的管口用灭菌脱脂棉松塞。将安瓿竖立在专用铝盒内，送入已经降温至-30℃的冻干箱内预冻。预冻1h后，继续降温2h后达-55℃。开启真空泵，升华干燥。干燥后加热升温至30℃，维持4～6h。工艺曲线见图5-4。菌种冻干后，放入带有吸湿剂的干燥罐内，抽真空后封口保存。郑星铭的研究报告中强调，冻结温度要低于牛乳的共晶点（-16℃）5～10℃，保证冻实。降温速率为10～15℃/h。第一干燥阶段除去90%以上的水分。第二干燥阶段除去结合水，温度相对要高，但不可高于30℃，以免影响制品的稳定性和活性。

5.2.5  麻疹减毒疫苗冻干 

麻疹病毒在液态下不稳定。多年的研究表明，麻疹病毒加入保护剂冻干后，稳定性明显改善。徐斌等通过正交实验研究了麻疹减毒活疫苗的冻干工艺。首先用电阻法测定麻疹减毒活疫苗的共晶点温度为-26℃。设计的正交实验因素水平见表5-7。

注：升华干燥E2过程，制品的温度始终控制在31℃以下。

实验研究中每次分装1800支、0.6mL/支麻疹减毒活疫苗进行冻干实验，然后对冻干制品进行水分、滴度、热稳定性检测，并计算干损率。实验研究的结果表明，优化的麻疹减毒活疫苗冻干工艺参数列于表5-8。以优化的麻疹减毒活疫苗冻干工艺冻干的制品成型良好，干损率平均为1.36%，稳定性好，残余水分在1.62%～1.67%之间。优化的麻疹减毒活疫苗冻干工艺适合麻疹疫苗大规模生产。

5.2.2 乳酸菌菌种冻干

能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌，共有200多种。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系。乳酸菌种在酸奶生产中是非常关键的物质，可以利用乳酸菌提高酿造和发酵食品的风味。乳酸菌冻干是将菌种速冻，然后在真空条件下升华，可以保持菌种的稳定结构和营养。冻干后，菌种酶化作用减弱，生物活性不变，常温下可贮存3～5年。加水后极易复原，复水率达90%以上。冷冻真空干燥乳酸菌发酵剂，具有活力强、用量少、污染低、品种多、方便储运等特点，已在欧美等发达国家得到广泛应用。

影响乳酸菌冻干效果的因素包括菌株、细胞大小形状、初始细胞浓度、降温速率、pH值、保护剂、预冻温度、干燥条件、复水条件等，其中冻干保护剂系统的影响较突出。研究表明，乳酸菌冻干前加入适当的保护剂，可影响乳酸菌在冻干过程中的细胞存活率和保藏期间的细胞稳定性。乳酸菌冻干保护剂的保护效果与其化学结构有着密切的关系，其特征是具备三个以上的氢键，而且具有以适当方式存在的游离基团。

5.2.2.1预冻方式对乳酸菌菌种冻干的影响

朱东升研究了预冻方式对冻干乳酸菌菌种活菌数的影响。实验中分别研究了嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌采用慢冻和液氮快冻后，冻干菌种活菌数与预冻方式的关系。具体实验方案为：将菌悬液盛入冷冻平皿中，将其先置4℃冰箱平衡30min后，移入-30℃冰箱60min,然后置-80℃冰箱60min,进行普通预冻，再在冷冻真空千燥机上冷冻千燥12h,密封保存于4℃冰箱中。其余菌悬液先置于冰箱保存30min后，用5mL、1mL、200uL、100uL枪头滴定于盛有液氮的冷冻平皿中10min,再在冷冻真空干燥机上冷冻干燥12h,密封保存于4℃冰箱中。实验设计冷冻真空干燥条件为：冻干室温度为-60～70℃，

压力为6mPa。

研究结果表明，三种菌种用液氮快冻都比普通慢冻存活率高，如图5-3所示。分析原因为，液氮预冻的速度比普通预冻的速度快很多，这样可以使细胞内部的水渗出到细胞外面，而水在细胞内部凝结正是细胞死亡的致命原因。此外，同样是用液  氯快冻，菌种液滴大小不同，其活菌数也不同，液滴小者活菌数高。当一定体积的菌液，由不同大小的液滴进行滴定，随总表面积增大，其存活率也增大。因为单位体积的菌液，其总表面积增大以后，水分的渗出速度也加快，所以存活率可以提高。

5.2.2.2冷冻干燥保护剂对乳杆菌冻干的影响

刘丹等研究了瑞士乳杆菌的冻干。将经过脱脂乳活化、培养基扩培并离心收集的瑞士乳杆菌菌泥与配制好的保护剂按1：1的比例混合，确定冻干前的活菌数后，注入冻干管中。冻干管在-75℃预冻2h,然后在60～120Pa下冷冻干燥32h，干燥后取出在4℃下保藏。用无菌生理盐水使冻干菌复水，确定冻干后活菌数，计算活菌率。实验研究中分别使用了单一保护剂和复合保护剂，实验结果列于表5-4和表5-5。

表5-4的数据表明，与对照组相比，加入保护剂后乳酸菌的存活率均有不同程度的提高，可见所选保护剂对乳酸菌都有一定的保护作用。其中以海藻糖的效果最为显著。与其他糖类相比，海藻糖的玻璃化相变温度高，更容易以玻璃态存在，对生物材料的稳定有很重要的意义。另外，生物体中的大分子均处于一层水膜包围保护中，这层水膜是维持其结构和功能必不可少的物质。干燥时水膜被除去，可导致这些大分子物质发生不可逆转的变化。若有海藻糖做保护剂，海藻糖可在生物分子的失水部位与这些分子形成氢键，使其在缺水条件下仍能保持其原有结构，保持活性。表5-5中的数据表明，与单一保护剂相比，使用复合保护剂冻干乳酸菌存活率更高。实验数据还表明，保护剂中海藻糖的在10.4%左右时效果更好，海藻糖浓度过高可能会抑制菌的生长。经过优化，最  佳的复合保护剂配比为10.4%海藻糖、11.2%脱脂乳和4%谷氨酸钠。

5.1  概述    

真空冷冻干燥制品在升华干燥过程中，其物理结构不变，化学结构变化也很小，制品仍然保持原有的固体结构和形态，在升华干操过程中，固体冰晶升华成水蒸气后在制品中留下孔隙，形成特有的海绵状多孔性结构，具有理想的速溶性和近乎完全的复水性，冷冻真空干燥过程在极低的温度和高真空的条件下进行的干燥加工，生物材料的热变性小，可以最大限度地保证材料的生物活性。制品在升华过程中温度保持在较低温度状态下（一般低于-25℃)，因而对于那些不耐热者，诸如酶、抗生素、激素、核酸、血液和免疫制品等热敏性生物制品和生物组织的干燥尤为适宜。干燥的结果能排出97%～99%以上的水分，有利于生物物质的长期保存。物质干燥过程是在真空条件下进行的，故不易氧化。实践证明，由于部分生物制品有特殊的化学、物理、生物不稳定性，冻干技术用于对它们的加工非常适合。

生物制品（如疫苗、菌种、病毒等）和生物组织（人体、动物体的器官等）的冻干与其他物品冻干工艺不同之处在于，它们在冻干过程中除了要达到一般物品冻干的指标要求外，在冻干过程中还要求不染菌、不变性，保留其生命力，保持生命活性，所以它们是所有冻干物品中工艺要求最为严格的。

疫苗、菌种、病毒等生物制品冻干后一般要制成注射剂，因此，总是先配成液态制剂，经冻干后封存，使用时加水还原成液态，供注射用。冻干生物制品注射剂是直接注射到人、畜血液循环系统中的。药剂若有污染，轻者造成感染，重者危及生命。因此，生产的各个环节都要特别注意消毒灭菌，保证产品的“无菌”要求。因此要对包括从盛装容器（安瓿、瓶塞等)到分装机、冻干箱、操作环境等所有可能与制品接触者进行灭菌消毒。

对生物组织的低温冷冻，可能引起细胞损伤，造成细胞损害的主要因素是冷冻引起的细胞内脱水，其次是机械性挤压作用。显微镜下观察红细胞在盐水和水溶液内冷冻时，可见到透明的网状冰结晶内有暗红色的红细胞聚积物。冰结晶开始呈网状，然后形成管状，最后形成一大片冰结晶。这样，细胞就可能被冰结晶挤压而受损伤。将细胞组织在冷冻过程中所受损害减低到最低限度，使细胞处于“生机暂停状态”主要的方法是应用冷冻保护剂、控制冷却速度和复温速度，以提高细胞在低温保存后的活力。

除人血浆等少数含干物质多的原料可以直接冻干外，大多数生物制品在冻干时都需要添加某种物质，制成混合液后才能进行冻干。这种物质在干燥后起支撑作用，在冻干过程中起保护作用，因此称为保护剂。有时也称填充剂、赋形剂、缓冲剂等。

冷冻保护剂能防止冰结晶对细胞的损害，可能是冷冻保护剂使最低共熔点降低，从而减轻或避免冷却或复温过程中冰结晶对细胞的损伤。冷冻保护剂依据其能否通过细胞膜而分为穿透性保护剂与非穿透性保护剂。穿透性保护剂，如二甲基亚砜(DMSO)的作用是：①使细胞外液溶质浓度降低，冷却时细胞摄取溶质量减少，为DMSO所取代：②DMSO进入细胞内，改变细胞内的过冷状态，使细胞内蒸发压接近细胞外，从而减轻细胞内脱水和细胞皱缩的速度与程度；③减少进入细胞内的阳离子量；④由于DMSO容易进出细胞，在复温时很少发生渗透性细胞肿胀。此外，业已证实DMSO是经皮肤断面穿透至皮肤内部，尤以在4℃下5～15min穿透量最多。非穿透性保护剂，如羟乙基淀粉由于不能穿透细胞膜，仅使细胞外环境保持过冷状态，在特定温度下减低细胞外溶质浓度，延缓细胞破裂；或者在冷却前使细胞内脱水，减轻细胞内结晶。冻干人用生物制品活菌菌苗、冻干活毒以及冻干其他生物制品通常所用的保护剂依次见表5-1～表5-3。

《关于开展第三次全国土壤普查的通知》

时隔40年，第三次土壤普查启动。国务院日前印发《关于开展第三次全国土壤普查的通知》，决定自2022年起至2025年用4年时间，遵循全面性、科学性、专业性原则，全面查明查清我国土壤类型及分布规律、土壤资源现状及变化趋势，真实准确掌握土壤质量、性状和利用状况等基础数据。 

普查对象为全国耕地、园地、林地、草地等农用地和部分未利用地的土壤。其中，林地、草地重点调查与食物生产相关的土地，未利用地重点调查与可开垦耕地资源相关的土地，如盐碱地等。

普查内容主要包括四个方面：立地条件普查，包括地形地貌、水文地质等；性状普查，包括有机质、酸碱度、养分情况以及颜色、质地等物理、化学性状；类型普查，包括不同成土母质、不同气候条件、不同地形地貌、不同利用状况下土壤类型的核实与补充完善等；利用状况普查，包括灌排设施情况、植物生长情况、种植制度等基础信息，以及肥料、农药、农膜等投入品使用情况。

冷冻干燥技术在土壤冻干中的应用

真空环境下，水分子直接由固态变成气态，对待测样品的化学性质、物理性质及生物活性无影响，有效避免汞等挥发性物质损失。

经冷冻干燥处理后，土壤样品含水率低，一般可低于5%，极限可达到0.01%，有利于后续处理和分析。

对于土壤类冻干后，土壤样品呈现酥脆多孔的特性，便于使用专用研磨仪进行研磨。

冷冻干燥可无人值守，连续运转，干燥效率高，效率可达自然风干燥、晾干及烘干效率的几倍。

上样量大，一台专业型设备一天可制备上百个土壤样本，一台设备即可满足样本前处理的需要。

冷冻干燥法采用冻干瓶的方式可避免不同批次及同批次的交叉污染。

方便快捷，对于半挥发性有机物检测，专用的土壤冻干瓶即可用于采样，也可用于冻干，还可以用来封存样本。

四环土壤冻干机的特点

控制软件系统为安卓系统，冻干过程均有可编程程序自动控制，可实时切换为人工操作，实现冻干过程全程参数控制，在运行过程中系统自动监控检测并记录储存相关数据，可储存多个固定或自定义程序，储存程序≥ 100，每个程序步骤≥ 36，实现三级管理，可通过标配远程系统进行监控和检测维护，支持大数据和智慧实验室建设，审计追踪；

连续记录实时数据，绘制冻干曲线，每分钟存储一次数据（数据存储记录间隔时间可调），具备 USB 数据存储串口；

控制系统人机界面设备符合 NEMA（国际电气制造业协会）防护规定和欧洲 CE 电气认证标准；

系统配有各种传感器，实时记录显示真空度、冷阱温度、物料温度、搁板温度，运行错误报警，可在运行过程中温度和压力出现异常时即时信息报警并主动保护运行，灯光报警（选配）；

冻干腔体内部圆角、表面粗糙度、搁板平整度、腔体内部材料均符合或高于国家相关标准；

物料原位冻干，冷阱腔体、物料盘架为卫生级不锈钢材料，冷阱内无盘管，搁板可以拆卸，光洁耐腐蚀且易清洁，根据物料容器高度需求通过调整搁板层数自由调整搁板间距，冻干使用面积任意组配（最大有效冻干面积 0.83m2 ）；

物料搁板具有程序梯度电加热功能，特殊航空加热膜，运用 PLD控制，内置过热保护，安全可靠；（LGJ-35C/50C/80C 除外）

冷阱外置提高设备的捕水能力，减少冻干过程中冷阱温度对物料的干扰，保证物料冻干质量一致性，提高冻干效率，降低能源损耗；

采用进口压缩机单机混合制冷技术，国际标准绿色环保冷媒，制冷迅速，冷阱温度低，捕水能力强；具有自动化霜功能；

选配 UPS 不间断电源；

自动复压掺气系统：减少样品二次污染，可定量（选配）回填氮气或惰性气体；

提供洁净室安装解决方案；

真空度全程自动控制，可选配真空度调节功能；

选配共晶点共熔点测试功能，更好的优化样品升华工艺；

选配上位机控制。

达标冷阱温度： ≤ -70℃ （空载，环境温度 ≤ 30℃）

极限冷阱温度： ≤ -75℃ （空载，环境温度 ≤ 25℃）

达标预冻室温度： ≤ -55℃ （空载，环境温度 ≤ 30℃）

极限预冻室温度： ≤ -61℃ （空载，环境温度 ≤ 25℃）

达标真空度： ≤ 5Pa（空载）

极限真空度： ≤ 1Pa（空载）

预冻室降温速率：20℃降至 -40℃≤ 60min（空载）

冷阱降温速率：20℃降至 -40℃≤ 20min（空载）

真空抽气速率：标准大气压降至 5Pa ≤ 15min（空载）

搁板控温范围：-40℃～ +70℃ （LGJ-35C/50C/80C 除外）

电源要求：AC380V 50Hz 三相五线制 或 AC220V 50Hz 

总功率：4000W

适用环境：≤ 30℃

关于四环冻干

四环福瑞科仪科技发展（北京）有限公司法人由原北京四环科学仪器厂有 限公司技术研发和管理负责人担任，是为客户提供专业真空冷冻干燥设备及解 决方案的服务供应商。我们秉承“以客户为中心，追求最高的客户满意度”的 服务理念，个性服务、创新设计、高效处理、可靠保障，可根据用户需求提供 和设计单个或多个符合 GMP 相关标准的冻干设备配套系统，如负压和无菌隔 离器、自动进出料及外置 CIP 等系统。 我们以共赢发展为本，技术服务为根，在臻于完善中与众不同，在持续发 展中追求卓越。 

个性服务：

专业沟通，科学分析，根据用户需求和物料 特性提供精准设备方案。

创新设计：

需求牵引，高端配置，结构紧凑，操作维护简单。

高效处理：

数字全程控制，实现系统优化，物料冻干高效。

技术保障：

快捷高品质的全寿命质量周期服务，保障产 品稳定可靠安全运行。

冻干枸杞是区别于普通晾晒枸杞的新型制作工艺枸杞。冻干枸杞是将鲜枸杞洗净后直接低温冷冻加工制成，由于只取出果肉中的水分而不破坏其他营养物质，冻干枸杞不但ZD化保留鲜枸杞中的各种营养精华成分，还解决了晾晒工艺存在的混入泥沙、虫卵等杂质的问题，最重要的是避免了晾晒枸杞添加碱水、亚硫酸钠和硫磺等过量化学物质而导致的食物中毒问题，是一款安全、无添加的绿色食品。

品类介绍

冻干枸杞，是近年来逐渐走俏的高科技绿色食品。相较于一般的晾晒枸杞，冻干枸杞在加工过程中保存了鲜枸杞原有的色、香、味、营养成分和原有的红润饱满外观，具有良好的复水性，而且不含任何添加剂，是理想的天然养生佳品，长期食用在明目方面功效更加显著。

技术介绍

冻干(Freeze Drying)全名为真空冷冻干燥(Vacuum Freeze Drying)，又名升华干燥(Drying by Sublimation)，是将被干燥液体物料冷冻成固体，在低温减压条件下利用冰的升华性能，使物料低温脱水而达到干燥目的的一种方法。

四环真空冷冻干燥机把含有大量水分的物质，预先进行降温冻结成固体。然后在真空条件下使水蒸气直接从固体中升华出来，而物质本身则留在冻结时的冰架子里，因此它干燥后体积不变，并且变得疏松、多孔、复水性能好。冷冻干燥蔬菜或食品，它ZD的特点就是保留产品的色、香、味、形及原生态食物的营养成分，也被称之为航天食品，是当今天然、绿色、安全的方便营养食品。

传统晾晒与冻干的区别

市场上大部分的晾晒枸杞卖相欠佳，普遍呈暗红、暗黄、干瘪状，而颜色鲜亮的晾晒枸杞则多为使用过量硫磺熏制的"磺货"，存在极大健康隐患。冻干枸杞则打破了枸杞干涩的僵局，在外观上保留了鲜果的饱满、红润、鲜亮， 这一突破性改变与冻干枸杞的特殊制作工艺密不可分。

传统晾晒工艺的做法是首先用碱水除去鲜果表面果蜡，进而通过不断翻动进行晾晒蒸发出鲜果中的水分。在晾晒过程中，枸杞因撞伤、挤伤、压伤等果肉会明显受损，导致营养大量流失且颜色发黑。且传统晾晒枸杞因晾晒过程中添加大量化学物质而产生的明显苦味、涩味和酸味，使得其口感相较于鲜果大打折扣。而冻干工艺因其技术本身的独特性，在根本上解决了晾晒工艺问题，从营养、卫生、口味等多方面实现工艺创新。

冻干枸杞因为是在低温真空的环境下生产，运用冻干技术升华果肉中的水分而没有破坏原有的物质结构，让冻干枸杞完整的保有鲜果骨架和形态的同时，还ZD化的保留了枸杞中各种营养成分。

由于在真空的生产环境下，微生物和酶都无法作用，使得枸杞能ZD化的保持鲜果的色、香、味。同时，不到5%的含水量也让冻干枸杞在生产后不需冷藏，只要密封包装，就可在常温下长期储存、运输和销售，三五年内不变质。

口感上也有了不同，冻干枸杞直接吃起来是咯嘣脆，不再像晒干枸杞那般干硬难嚼。如果加水浸泡，冻干枸杞还能在几分钟内恢复鲜果的形状，散发出浓郁的枸杞果香。

四环冻干

四环冻干机均通过国家质检机构检测，取得CE认证，得到客户的一致好评。四环福瑞科仪科技发展(北京)有限公司法人由原北京四环科学仪器厂有限公司技术研发和管理负责人担任，是为客户提供专业真空冷冻干燥设备及解决方案的服务供应商。我们秉承“以客户为ZX，追求ZG的客户满意度"的服务理念，个性服务、创新设计、GX处理、可靠保障，可根据客户需求提供和设计符合GMP相关标准的冻干配套设备。我们以共赢发展为本，技术服务为根，在臻于完善中与众不同，在持续发展中追求ZY。

摘要

冻干技术

冻干是一种在真空下低温升华除去水分的方法。这是一种相对温和的干燥方法，适用于脆弱的生物大分子或胶体纳米颗粒。然而，mRNA-LNPs的干燥是一种更复杂的技术，因为冷冻和脱水的过程会引入机械力，使载体结构变形，导致载体聚集、mRNA断裂或泄漏。使用准确温控，残留含水量较低的优化冻干技术，可以有效地保持mRNA-LNPs长期保存的理化性质和生物活性。图1可以看出，冻干后的LNPs，其大小和多分散性指数变化不大，说明优化后的冻干工艺没有改变其基本物理性质。

图1.LNPs电镜图

图2.冻干及复溶后mRNA-LNPs状态图

在冻干过程中，升华时除去水分子，填充糖分子以维持mRNA-LNPs的结构完整性；而复溶后的液体呈均匀半透明状，与新鲜制备的mRNA-LNPs无差异（见图2）。并且，经毛细管电泳检测后发现，mRNA的完整性也得以很好地保持（见图3），表明冻干过程没有破坏mRNA的结构。

图3.毛细管电泳分析图

冻干mRNA-LNPs的长期稳定性

图4.冻干LNPs长期稳定性分析图

在4°C和25°C条件下，冻干6个月内的LNPs，其大小、PDI、EE或mRNA完整性均无明显变化（见图4）。且在25°C条件下，6个月后，LNPs仍能保持良好的纳米形态（见图1）。

图5.HPLC-CAD成分分析图

此外，我们通过高效液相色谱电雾式检测器法（HPLC-CAD）分析脂质。结果显示，四种脂质成分均定量的存在，没有脂质降解的迹象。由此分析，冻干mRNA-LNPs能保持良好的物理性质应归因于超低的含水量（< 2%）和含氧量（未检测到密封瓶漏气）。

Omicron mRNA冻干疫苗能同时诱导高水平的体液免疫和细胞免疫

图6. LyomRNA-Omicron激活免疫数据图

分析图6中的数据可以得到：Omicron RBD的结合抗体滴度与疫苗使用剂量有相同的变化趋势（图6a、b）；且冻干疫苗能更强的激发CD4+、CD8+T细胞的产生（图6c、d）；对于OmicronBA.1 / BA.2 / BA.3，LyomRNA-Omicron也有较好的中和效果，但对BA.4的中和活性与BA.1相比，GMT降低了20倍。总的来说，LyomRNA-Omicron可诱导有效的体液免疫和Th1显性细胞免疫。

Omicron mRNA冻干疫苗可增强人体免疫

图7.LyomRNA-Omicron人体内免疫数据图

为多名志愿者接种LyomRNA-Omicron作为加强疫苗，接种后无严重不良反应，安全性良好，且针对不同的变异株，抗体滴度均有大幅提升（见图7）。因此，LyomRNA-Omicron适合作为灭活疫苗的加强疫苗，对SARS-CoV-2野生型和Omicron变体均具有良好的免疫效果。

结论
mRNA-LNPs疫苗的不稳定性，决定了其低温冷链储运的苛刻条件，这极大地限制了疫苗的可获得性。文中，作者通过优化的冻干技术，成功的实现了mRNA-LNP疫苗在更高温度下的长期保存。此技术的应用对mRNA疫苗的存储和运输提供了更大的可能性，对于SARS-CoV-2等流行疾病的广泛预防提供了更强的助力。

参考文献
[1] Ai, L., Li, Y., Zhou, L. et al. Lyophilized mRNA-lipid nanoparticle vaccines with long-term stability and high antigenicity against SARS-CoV-2. Cell Discov 9, 9 (2023). https://doi.org/10.1038/s41421-022-00517-9