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ELISA实验中,夹心法和竞争法的区别是什么?

乐于做人 2017-01-15 10:05:40 991  浏览
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  • hdbdmxJicnsnZn 2017-01-16 00:00:00
    双抗体夹心法是检测抗原Z常用的方法,操作步骤如下: 1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质. 2) 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质. 3) 加酶标抗体,保温反应.固相 免疫 复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关. 4) 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体Z好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测. 在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的Z高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应. 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题. 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标(参见6.2). 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心. 2.2 双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似.用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体.与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法.乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法.本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法. 竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体.其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合.标本中抗体量越多,结合在固相上的酶标抗体愈少,因此阳性反应呈色浅于阴性反应.如抗原为高纯度的,可直接包被固相.如抗原中会有干扰物质,直接包被不易成功,可采用捕获包被法,即先包被与固相抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原.洗涤除去抗原中的杂质,然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应.竞争法测抗体有多种模式,可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合,抗HBc ELISA一般采用此法.另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合,洗涤后再加入酶标抗体,与结合在固相上的抗原反应.抗HBe的检测一般采用此法. 2.5 竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式.其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合.标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,Z后的显色也愈浅.小分子激素,药物等ELISA测定多用此法.

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  用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清(浆)。本实验室用ELISA测定乙肝两对半,甲肝,戊肝,抗HIV的标本时,在处理和保存方面要考虑以下几个方面:

  1)要注意避免出现严重溶血及血清中混有红细胞。当标本出现严重溶血及血清中混有红细胞时,反应孔不易洗净,残留在反应孔内的血红蛋白具有过氧化物酶的活性,显色时可能造成假阳性。

  2)标本凝固不全强行离心,造成血清中含有少量的纤维蛋白原,在实验过程中形成纤维蛋白吸附在反应孔孔壁上不易洗掉,易造成假性结果。

  3)血清标本可在2~8℃下保存1周。如血清样本需长时间保存,则需放入-20℃冰柜内冰冻保存。冰冻保存的血清标本须注意避免反复冻融,标本可能引起假阴性结果。此外冻融标本的混匀不要进行剧烈振荡,应反复颠倒混匀。

  ELISA测定中试剂准备:

  在实验开始前,将试剂盒先从冰箱中拿出来,在室温下放置20分钟以上后,再进行测定,证试剂盒温度要和室温一致。如果把试剂盒从冰箱拿出来直接做实验会造成一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因为在后面的孵育反应步骤中,造成孵育时间不够。其次,ELISA实验中洗板用的洗液需每日更换配制,稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。

  加血清样本及反应试剂:

  血清样本使用微量加样枪加样。使用微量加样枪加样必须注意避免以下几点:

  1)加样太快,无法保证微量加样的准确性和均一性。需匀速加样,吸样时,加样枪需按到第一档,加样时,加样枪需直接按到底。

  2)加样应直接加入反应孔底部,加在反应孔孔壁上易溅出会对邻近孔产生污染。尽量避免出现气泡。

  3)反应试剂的加入时先要注意试剂的有效期,再注意滴加的角度和滴加的速度。滴加太快易出现重复滴加或加在两孔之间。

  温育的时间与温度:

  温育是ELISA测定中最容易出现问题的步骤。温育温度应在37℃,水浴。温育时间应按照试剂说明书上的时间严格执行。温育实际测定操作中要注意以下几点:

  1)要保证在设定的温度下有足够的反应时间。温育时间不够,弱阳性样本测不出来。

  2)因为采用水浴,所以在温育时一定要封板,防止水蒸气形成水滴掉入反应孔内造成污染,并有可能整板花板。

  ELISA测定的洗板:

  全自动洗板机的使用应注意以下几点:

  1)洗板前,应检查洗液瓶、蒸馏水瓶是否充足,废液瓶是否满瓶

  2)在自检过程中注意观察洗液灌注是否通畅,排液是否通畅。

  3)在洗板过程中,应注意观察反应孔每孔是否灌满且无外溢,每孔吸水是否吸尽,并且要保证洗液在孔中放置的时间。

  BUNSEN本生提醒:ELISA测定以TMB为底物的显色

  加入底物开始显色反应前,先检查一下底物溶液的有效期。滴入A、B显色剂后,需温育15min,最后加入终止液终止反应,振荡混匀后即可进行下面的比色测定判断结果。在此过程中应注意不要把显色剂和终止液滴入顺序弄反,否则重做实验。

  ELISA的比色测定

  ELISA的比色测定由酶标仪进行测定,故需强调比色测定时,一定要注意酶标仪的波长是否是双波长(450nm和630nm)。

  ELISA测定结果判定

  结果判定一般是根据比色结果和肉眼观察综合判定。如在判定过程发现有些反应孔出现倒阴不阳的现象或出现不常见的模式(如乙肝两对半中出现12阳性等),需本着严谨的态度,重新复查。

  对ELISA测定中出现问题的可能原因(非试剂盒本身的原因),总结如下:

  1)弱阳性质控样本检测不出温育的时间或温度不够;显色反应时间太短;所用配制缓冲液的蒸馏水有问题。

  2)测定的重复性差,这是由于测定操作引起的问题,包括

  ①加样本及试剂量不准;孔间不一致

  ②加样过快,孔间发生污染

  ③加错样本

  ④加样本及试剂时,加在孔壁

  ⑤不同批号试剂盒中组分混用

  ⑥温育时间、洗板、显色时间不一致

  ⑦孔内污染杂物,

  血清标本未完全凝固即加入,反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞,易出现假阳性等。

  3)全部孔都不显色

  ①漏加酶结合物;

  ②洗板液配制中出现问题

  ③漏加显色剂A或B

  ④终止剂当显色剂使用

  4)全部板孔均有显色

  ①板不干净

  ②显色液变质

  ③洗板液受酶等污染

  ELISA试剂盒 本生一直视质量控制为企业的生命,追求企业竞争力的不断提升。公司在经营中始终秉承:遵纪守法,严于律己,宽仁以待,敢于承担的企业精神作为标准,以过硬的质量和优良的服务来维护和拓展市场,较大限度的满足客户的需求。与客户的共赢,是我们的发展目标。本生!您信任的合作伙伴。我们愿与您真诚合作,共创美好的未来。

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elisa实验:怎么保存ELISA试剂盒?

  elisa实验:怎么保存ELISA试剂盒?


  (1)要留心避免出现严峻溶血。血红蛋白中含有血红素基团,其有类似过氧化物的活性,因而,在以HRP为符号酶的ELISA试剂盒测定中,如血清标本中血红蛋白浓度较高,则其就很简单在温育进程中吸附于固相,然后与后边参与的HRP底物反响显色。

  (2)样本的收集及血清别离中要留心尽量避免细菌污染,一则细菌的成长,其所分泌的一些酶或许会对抗原抗体等蛋白发作分化效果;二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作符号的测定方法发作非特异性搅扰。

  (3)血清标本如是以无菌操作别离,则可以在2~8℃下保存一周,ELISA试剂盒如为有菌操作,则建议冰冻保存。样本的长期保存,应在-70℃以下。

  (4)冰冻保存的血清标本须留心避免因停电等形成的重复冻融。ELISA试剂盒标本的重复冻融所发作的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子发作损坏效果,然后引起假阴性效果。此外,冻融标本的混匀亦应留心,不要进行剧烈振动,重复倒置混匀即可。

  (5)标本在保存中如出现细菌污染所形成的的混浊或絮状物时,应离心沉积后取上清检测。Elisa试验是一种敏感性高,特异性强,重复性好的试验确诊方法。因为其试剂安稳、易保存,操作简洁,效果判断较客观等要素,已广泛应用在免疫学查验的各领域中。ELISA试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎(HEV)病毒 IgM 抗体ELISA检测。成长环境之中的有用因子和营养成分进行更好的了解,确保这种血清原材料的成长活性和可靠性更高,以更加的品质让这种动物细胞培养的活性得到大幅度的提升;

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2023-08-24 10:15:26 72 0
怎样减少ELISA检测试剂盒实验中的误差?

  怎样减少ELISA检测试剂盒实验中的误差?

  ELISA检测试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎(HEV)病毒 IgM 抗体ELISA检测。ELISA检测试剂盒试验是一种敏感性高,特异性强,重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存,操作简便,结果判断较客观等因素,已广泛应用在免疫学检验的各领域中。但是您知道吗?如果您在实验过程中犯了以下几个小错误的话也会出现实验误差的哦!下面跟随天津本生小编来看看下:

  1.做实验时少说话,防止唾液掉进酶标条中。

  2.加入一抗二抗需要放入37°。

  3.如果同时做多个板子,多个板子别罗一起;尽量少用排枪。

  4.加样时,由低浓度向高浓度加,这样减少跳孔的几率。

  5.勤换枪头。

  注:

  一、移液器的使用,加样(抗体)等需要准确定量的试剂时不使用排枪,经验证明排枪很不准确,极易跳孔,不要图便宜买低档的tips 因为ELISA不但会放大被检测的目的蛋白,也会放大非特异结合的杂质蛋白。

  二、倍比稀释样品时,稀释倍数要小于10。

  三、所有的装跟ELISA检测试剂盒相关试剂的容器,玻璃制品的要干烤过或者使用一次性的树脂容器。

  怎样减少ELISA检测试剂盒实验中的误差?我司由具有行业背景和丰富市场经验的业人士组成,于为生命科学研究域提供产品,为广大科研工作者提供服务。 既能满足研发类客户对产品种类、包装的特殊要求,也能满足生产型企业从小试、中试到规模化生产各个阶段的综合需求。本生!您信任的合作伙伴。我们愿与您真诚合作,共创美好的未来。

2021-10-19 10:34:21 205 0
如何减少ELISA试剂盒实验中背景因素?

  如何减少ELISA试剂盒实验中背景因素?

  ELISA试剂盒实验的原理在我们平时看来觉得很简单,无非就是固定抗原,添加一抗、二抗和底物,间中夹杂着洗涤和闭。然而,即使是平常的洗涤和封闭,如果做得不太好,也有可能影响整个实验。在做完实验时,我们是否能获得有用的信息,这在很大程度上取决于结果的信噪比。背景噪音会直接关系到结果的判断。那么怎样才能降低ELISA试剂盒实验中的背景因素呢,我们一起来了解。

  洗涤很重要

  洗涤步骤看似很无聊,其实很重要,因为如果未结合的材料(如非特异结合的抗体或检测试剂)残留在微孔板中,那么它会增加背景噪音。如有必要,可增加洗涤液中的盐浓度,这会阻止非特异结合反应。如果背景过高,而您怀疑洗涤不够时,可以尝试增加洗涤次数。

  封闭更关键

  封闭液的作用是让不相关的蛋白占据微孔板中潜在的结合位点。这就降低了可产生信号的抗体非特异结合的机会。您当然也希望抗体只与目的蛋白结合吧。如果您的背景过高,怀疑封闭不充分,那么您可以尝试使用更高浓度的封闭液,或适当延长封闭时间。如果您一直被背景问题所困扰,那么也许您该花些时间来优化封闭液。这可能需要时间,但也是值得的。目前主要有两种类型的封闭液:蛋白和非离子型去污剂。您使用的类型须取决于多个因素,包括微孔板的表面试剂、吸附的抗原、您的抗体和检测试剂。好的封闭液应降低非特异性结合,但它不应当与抗原、抗体或检测试剂发生相互作用。zui常用的非离子型去污剂是Tween-20。这种封闭液便宜、稳定,在去除洗涤过程中的一些非特异结合上很有用。但它们只在存在时起作用,因为很容易被洗掉。因此所有洗涤液中也必须添加封闭液。请勿使用高浓度(正常浓度为0.01-0.1%),它会降低特异结合,产生假阴性。另一个选择是使用蛋白和非离子型去污剂这两种封闭液,后者可协助洗涤过程中的封闭。蛋白封闭液则有所不同。它们与开放位点结合并封闭,同时稳定与微孔板结合的抗原分子。常用的蛋白封闭液包括牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉、正常血清和鱼明胶。

  抗体浓度须优化

  如果试剂稍有不同,则可能需要优化抗体的量。记住,非特异的抗体结合会增加背景。为了防止这一点,切勿使用过多的一抗或二抗。

  检测试剂要适量

  另一点也很显而易见:切勿使用过多的检测试剂。如果浓度过高,或者未正确稀释,则会导致高背景。也不要显色过度,如有必要,优化一下何时应加入终止液。

  相信在注意这些细节后,我们就可以降低ELISA试剂盒实验中背景因素,才可以获得我们想要的结果信息。

  本生(天津)健康科技有限公司由具有行业背景和丰富市场经验的专业人士组成,于为生命科学研究领域提供产品,为广大科研工作者提供服务。  既能满足研发类客户对产品种类、包装的特殊要求,也能满足生产型企业从小试、中试到规模化生产各个阶段的综合需求。

  产品涵盖有荧光定量PCR耗材(八联管,单管,96孔板,384孔板,封板膜,辅助器等),ELISA试剂盒,移液器吸嘴,离心管,冻存管,培养皿,培养板,培养瓶,吸头,仪器及手套,培养基,抗体,血清,色谱耗材,针头过滤器及实验室常用耗材。  品种类超过万种,广泛应用于科研院校、ZX实验室、分子生物学等科研领域。

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ELISA实验要点:降低ELISA背景的四大要素

  ELISA实验要点:降低ELISA背景的四大要素

  在ELISA试剂盒操作中,我们都认为ELISA实验的原理似乎很简单,不外乎固定抗原,添加一抗、二抗和底物,间中夹杂着洗涤和封闭。然而,即使是平淡无奇的洗涤和封闭,如果做得不太好,也有可能毁了整个实验。在实验结束时,我们是否能获得有意义的信息,这在很大程度上取决于结果的信噪比。背景噪音会影响您对结果的判断。如何降低ELISA的背景,本生技术小编详解。

  一、洗涤很重要

  洗涤步骤看似很无聊,其实很重要,因为如果未结合的材料(如非特异结合的抗体或检测试剂)残留在微孔板中,那么它会增加背景噪音。如有必要,可增加洗涤液中的盐浓度,这会阻止非特异结合反应。如果背景过高,而您怀疑洗涤不够时,可以尝试增加洗涤次数。

  二、封闭更关键

  封闭液的作用是让不相关的蛋白占据微孔板中潜在的结合位点。这就降低了可产生信号的抗体非特异结合的机会。您当然也希望抗体只与目的蛋白结合吧。如果您的背景过高,怀疑封闭不充分,那么您可以尝试使用更高浓度的封闭液,或适当延长封闭时间。

  如果您一直被背景问题所困扰,那么也许您该花些时间来优化封闭液。这可能需要时间,但也是值得的。目前主要有两种类型的封闭液:蛋白和非离子型去污剂。您使用的类型须取决于多个因素,包括微孔板的表面试剂、吸附的抗原、您的抗体和检测试剂。好的封闭液应降低非特异性结合,但它不应当与抗原、抗体或检测试剂发生相互作用。

  常用的非离子型去污剂是Tween-20。这种封闭液便宜、稳定,在去除洗涤过程中的一些非特异结合上很有用。但它们只在存在时起作用,因为很容易被洗掉。因此所有洗涤液中也必须添加封闭液。请勿使用高浓度(正常浓度为0.01-0.1%),它会降低特异结合,产生假阴性。另一个选择是使用蛋白和非离子型去污剂这两种封闭液,后者可协助洗涤过程中的封闭。

  蛋白封闭液则有所不同。它们与开放位点结合并封闭,同时稳定与微孔板结合的抗原分子。常用的蛋白封闭液包括牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉、正常血清和鱼明胶。血清组分的内在多样性可使它有效拦截许多不同类型的分子相互作用。不过,它的缺点在于能与Protein A和IgG抗体相互作用。解决这个问题的一种方法是使用鸡或鱼的正常血清。

  三、抗体浓度须优化

  我们通常会follow师兄师姐留下来的操作步骤,但是如果试剂稍有不同,则可能需要优化抗体的量。记住,非特异的抗体结合会增加背景。为了防止这一点,切勿使用过多的一抗或二抗。

  四、检测试剂要适量

  另一点也很显而易见:切勿使用过多的检测试剂。如果浓度过高,或者未正确稀释,则会导致高背景。也不要显色过度,如有必要,优化一下何时应加入终止液。

  如果您的ELISA试剂盒操作中不幸地遇到了高背景,那么也无需太担心,依次查看ELISA系统中的组分,并排除可能存在的问题。悉心优化,相信很快就会有漂亮的结果。

  ELISA试剂盒本生一直视质量控制为企业的生命,追求企业竞争力的不断提升。公司在经营中始终秉承:遵纪守法,严于律己,宽仁以待,敢于承担的企业精神作为标准,以过硬的质量和优良的服务来维护和拓展市场,较大限度的满足客户的需求。与客户的共赢,是我们的发展目标。本生!您信任的合作伙伴。我们愿与您真诚合作,共创美好的未来。



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