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　　01、故障排除

　　免疫荧光染色是一种非常敏感的方法，需要大量的经验和不断优化。方案中微小的变化可以显着改变结果。如果遇到低信号、无信号或高背景，请参阅以下故障排除指南：

　　高背景：

　　02、ibidi解决方案

　　用于倒置显微镜的具有盖玻片底部的ibidi μ-Slides腔室载玻片和μ-Dishes培养皿有多种几何形状可供选择，可满足您对免疫细胞化学的任何特定需求。所有免疫荧光染色步骤都可以直接在载玻片或培养皿中进行。

　　ibidi通道载玻片的几何形状非常适合精确交换少量的培养基，这在免疫细胞化学染色过程中是必要的。此外，通道µ-Slides的盖玻片底部无需额外的盖玻片。

　　在ibidi腔室载玻片中，带有可移除的硅胶培养小室安装在标准玻璃盖玻片上，非常适合长时间样品保存。

　　03、低信号或无信号

（一）显示结果中氧气含量高而二氧化硫和氮氧化物含量低

（1）可能原因之一：采样管路泄漏。

处理方法：检查样气取样回路。

确认办法：加标准气体到烟气分析仪的入口，观察测量结果与标准气体的含量是否相同。若测量值与标示值相同，则证明采样管路泄漏。分析采样管路泄漏需要分两个步骤判断是机柜内部泄漏还是机柜外部泄露。判断方法：把样气阀入口断开，用手堵死，此时分析仪面板上的浮子流量计标示应该归零。若分析仪面板上的浮子流量计显示零则可判断机柜内部无问题，是机柜外部泄露，这时应检查采样探头与采样探头的滤芯堵头是否泄漏，找出泄漏处进行处理。

（2）可能原因之二：蠕动泵接头松动而导致漏气。

处理方法：重新旋紧蠕动泵接头即可。

（二）显示结果中氧气和氮氧化物含量测量数据不变而二氧化硫含量低甚至为零，检查发现保护过滤器内有水雾或积水

（1）冷凝器温控器故障排查。冷凝器中的玻璃冷腔下端结冰，温控器显示“LLL”，关闭冷凝器电源几小时后，再接通冷凝器电源，温度从 10℃左右慢慢下降至-5℃，后又显示“LLL”。对冷凝器气体除湿的基本原理进行分析得知，冷凝器通过对蓄冷体不断进行制冷，当过冷时又对其进行加热，使蓄冷体恒温在 1～7℃的某一温度值上。插在蓄冷体中间的交换器，借助导热介质和足够的换热面积迅即完成热交换。此时，流经交换器工作腔含水分的气态试样迅速冷却，使气体中的水分得到分离。经分析检测判断为玻璃冷腔外层加热片损坏所致，起不到加热作用。

处理方法：更换加热片，故障排除。

（2）蠕动泵排水故障排查。在实际工作中笔者发现一种疑难故障，监测过程中二氧化硫测量值突然变小，仅为 2~3 mg／m3甚至为零，比实际值偏低很多，一段时间后恢复正常，再过一段时间测量值又变小，如此多次重复该现象。用标准气体检查，气体分析仪示值准确，零点校准也正常，初步分析原因为样气有时含有水汽。首先怀疑蠕动泵泵管老化，但更换泵管后故障依旧。经过多日蹲守现场进行跟踪，观察发现为冷凝器的玻璃冷腔至蠕动泵的排水系统异常所致。由于烟气排放监测设备安装时，在冷凝器的玻璃冷腔至蠕动泵的进水端连接了较长的管路，导致玻璃冷腔排水管下垂部分较长，管路经 U型接至蠕动泵进水端，阻力较大。初安装时，由于蠕动泵泵轴、泵管较新，U 型管的积水可以抽出；使用一段时间后，蠕动泵泵轴出现磨损，密封性能下降，真空度降低，因而出现排水有时正常、有时不正常的故障。

处理方法：对蠕动泵的排水系统进行改进，缩短玻璃冷腔到蠕动泵进水端连接管的长度，将玻璃冷腔的排水管直接跨接至蠕动泵的进水端。经过一段时间的现场观察，结果表明改造后效果良好。

（3）蠕动泵管及泵轴故障排查。蠕动泵管老化变形，失去弹性；蠕动泵泵轴磨损严重易形成堵塞，使冷凝水不能及时排出，造成出口样气大量带水，影响抽吸单元和分析组件的正常运行。

处理方法：在日常维护中应定期检查、更换蠕动泵管或泵轴。

（4）蠕动泵进出水端故障排查。蠕动泵进水端和出水端接反会造成样气大量带水。

处理方法：将蠕动泵进水端与出水端对调。

（三）零点标定后二氧化硫显示负值

故障分析：该故障表现为，隔一段时间二氧化硫测量值很小，仅为 2~3 mg／m3甚至为零，比实际值偏低很多，过很长时间才正常，过一段时间又重复该故障。经过认真分析研究，发现是零点漂移所致。

由于仪器自动零点标定时采用空气校准，而空气校准对采样空气的湿度有特定的要求，校准空气需用干燥空气（仪器所附技术资料没有说明），而南方空气比较潮湿，特别是春天或雨季，容易导致仪器自动零点校准时零点漂移的大、小随空气湿度的改变而变化。

处理方法：对标定系统进行改进，在采样空气前端增加电子制冷器进行干燥处理。

（四）烟气分析仪检测结果误差偏大

（1）可能原因之一：烟气分析仪长期没有标定，造成分析误差越来越大。

处理方法：对烟气分析仪进行标定。

（2）可能原因之二：所用标准气体超过有效期。

处理方法：标准气体的浓度是一个已知的固定值，每一种标准气体都有有效期，超过有效期后，标准气体的浓度发生变化，不能准确标定分析仪器。

处理方法：更换标准气体。

（3）可能原因之三：传感器气室内有脏物。

处理方法：打开传感器气室（打开时注意装有样品气体的玻璃管），使用脱脂棉、擦镜纸、洗涤剂或合适的溶剂（例如无水乙醇）将镜片及气室擦干净。要避免使用腐蚀性的清洗化合物，因为这些物料会损坏光学表面。

（五）含尘量指示不合理或数值持久不变

故障分析：含尘量测试仪镜头脏污。

处理方法：擦拭镜头并手工校准。

2.保留时间问题

2. 保留变量（时间变动）

如果所有峰（色谱峰）的保留时间均发生了变化，其致因很可能是如下因素发生了变化：流动相的组成、色谱柱的化学性质、色谱柱的温度或流速。

如果等度或梯度流动相在在线式混合中出现错误，也可能导致保留时间出现问题。

下面将简要介绍这些问题来源（对上述每个原因都简述如下）。

2.1.如果操作人员操作不当，则会导致流动相组成的意外变化，例如使用在线式混合系统时，流动相混合物（系统）设置不正确；或替换新批次流动相时，未妥善制备新的流动相（新流动相配制不正确）。

在极少数情况下，会出现流动相组分选择性损失的情况，例如蒸发。

当流动相发生变化时，峰形（色谱峰）通常会向相同的方向移动，以缩短或延长保留时间（保留时间变长或变短）；而相对保留（选择性因子，a）通常会发生变化。

检查流动相组成错误的Z佳方法是仔细检查（复查）系统设置；如有必要，应制备新的流动相。

方法文件应包含特定流动相变化影响的相关信息。例如，有机溶剂或pH值的微小变化会对色谱图产生特征（在色谱图体现出特征性的）影响，如分辨率或保留的变化（分离度的变化或保留时间的漂移）。

如果您怀疑设备出现故障，请将色谱柱和流动相移至另一个HPLC系统，然后再次运行。

如果问题依然存在，则问题在于流动相或色谱柱；如果问题不再出现，则可能与其他系统组件或参数相关。

2.2.色谱柱化学（化学性质）变化会在色谱柱的整个生命周期内出现，并且一般会在数周或数月内逐渐变化。柱老化一般伴随着柱背压的上升、保留时间的逐渐变化（漂移）（更长或更短）以及更多的峰拖尾。

更换新柱以确定是否是柱老化导致的问题（可确证色谱柱老化）。

500-2000次注射（进样）的柱寿命是较为理想的；在这一点上，柱成本相较于整体分析，是十分微小的，所以更换新柱的可行性较高（色谱柱在整个分析的成本中所占比例低，因而可以合理更换色谱柱）。

如果色谱柱的使用寿命过短，应仔细检查操作条件，以确保它们适用于该色谱柱。

图5显示了在极端操作条件下，色谱柱寿命较短的示例（缩短的寿命）。

2.3.色谱柱温度变化会导致保留时间的变化：每1°C的温度变化会引起1-3％的保留时间变化。如果不使用柱温箱（即“室温”条件），由于实验室温度的变化，温度通常会在日间（和夜间）循环（周期性）变化。

虽然在室内恒温器的测量下，实验室温度显示为恒定，但是HPLC系统的微观（微）环境可能会发生显著变化，尤其是当供暖或空调通风口直接吹向系统时，温度变化极为明显。

使用柱温箱可以避免色谱柱出现这样的温度问题，且HPLC系统应远离通风口放置。

2.4.流量（流速）问题可能是因存在气泡、泄漏或泵问题（故障）导致的。
气泡问题应和低压（或脉动压力）以及保留时间的增加相关（可能伴有柱压过低或柱压波动，且保留时间延长）。

对于双头泵，如果只有一个泵头存在气泡，则流量和压力可能会发生脉动（跳动）。

应对流动相进行脱气，然后打开放气阀清空泵，并向泵中多次加入5-10mL的流动相，以正常流速流经泵，从而排出气泡（打开排气阀以正常流速的几倍泵入5-10ml流动相经过泵，以排出气泡）。

在某些情况下，可能需要使用低粘度的脱气溶剂，如甲醇（MeOH）或乙腈（ACN）来清除泵中顽固的气泡。

泄漏也会延长保留时间。配件（接头）上的滴水配件或玻璃体内的结晶沉淀都是泄漏的证据（查看接头如有液滴或结晶析出，可证明有泄露）。

请特别注意色谱柱上游的配件（之前的接头）。

自动进样器内的配件和密封件（接头和密封圈）可能难以检测，可借助手电筒和小镜子进行检查。

如果使用不锈钢配件，通常1/4的紧固螺母（将接头螺好再拧紧1/4圈）便可以阻止泄漏。

使用PEEK配件（接头）时，应停止泵，松开接头，将管子推到配件（接口）端口的底部，然后在重新启动泵之前拧紧配件（接头）。

拧紧PEEK配件（接头）时如果存在流动的液体，会导致管道在配件中滑动，产生柱外死体积，进而影响分离效果。

存在缺陷的止回阀（单向阀）或磨损的泵密封件（圈）会导致流量偏低或波动。

止回阀（单向阀）出现问题将导致压力的波动。如果在清除泵中气泡后还无法改善压力波动的情况，则止回阀（单向阀）可能存在故障。

可以更换新的止回阀（单向阀）；也可以将止回阀（单向阀）放置在（装有）MeOH的烧杯中，对其进行超声处理，以实现有效的清洁。

如果无法有效区分入口端和出口端之间的止回阀（如不易分清入口单向阀和出口单向阀），请划线标记或用标签标记烧杯。将每个止回阀（单向阀）放入单独的烧杯中进行清洁，使其分开清洁。如果部件滑出，应小心组装，以免受到污染（无尘手套，避免划伤部件等）。

随着使用时间的增加，泵密封件（圈）会出现磨损；而且使用缓冲流动相或将其置于高盐条件下（例如离子交换法），会缩短它的使用寿命。

您可以建立一个预防性维护计划，定期更换密封件并做相应记录（准确记录更换密封圈的时间间隔，就可以建立预防性的维护计划），从而在故障发生前更换密封件。如果无其它指标（征兆），应至少每年更换一次密封件（圈）。

2.5.比例阀和在线混合发生故障会降低梯度洗脱的效果（使梯度洗脱效果变差）。

图6示例显示了两次连续注射肽样品的梯度洗脱分析。在这种情况下，系统适用性测试允许两次运行之间存在0.1分钟的变化（保留时间变化）；diyi个峰值不符合该标准，Z后一个峰值勉强通过而中间两个峰值明显超出规定值。

图6. 两个连续梯度运行的（两次连续梯度洗脱）色谱图显示了梯度中点附近的峰形具有较大的误差（保留时间的误差较大）（13分钟）。来源[3]。

下面介绍了一种检查流动相配比（混合）精度的简单方法。

将柱更换为0.005英寸直径约1米长（0.12mm）的管道（取下色谱柱，换上长约1米，内径0.005英寸（0.12mm）的管路），在A容器中加水，且B容器中放有含有0.1％丙酮的水，将检测器波长设置为265nm，并使用足够高的流速使止回阀（单向阀）能够有效工作（例如2mL/min）。

以10％为增量运行一系列梯级（梯级实验）（10％、20％、30％……90％、100％B）。

由于问题经常出现在50％B附近，所以在45％B和55％B处增添了额外的梯级。

其结果应是平滑的阶梯状（参见图8a）。

对于图6的样品，在40％-60％B的梯级中观察到图7的曲线。

梯级是扭曲的（已变形），且45％到50％B的梯级（梯级变化）是8.4％而不是5％。

图7中的虚线近似于（拟合了该）梯度，同时（在）45％和50％B之间存在偏移。

因此，此处应是由具有较大保留变量的峰被洗脱导致的（不幸的是，这正是那些保留时间偏差较大的峰出峰的位置）。

HPLC系统可对比例阀进行调节。

当执行此操作时，梯级会变得平滑且保留时间也会处于规格范围之内。

图7. 在图6的梯度中点附近执行配比（比例）阶梯测试的结果。理论值显示在括号内。来源[3]。

如果系统性能良好，其阶梯测试的结果应与图8a类似，在整个图中呈现阶梯状。

未注射的0-100％B梯度是应运行的对比测试（另需同时进行一无进样的0-B梯度试验）。

它应显示为线性基线、线性梯度部分和线性后期梯度保持，每个部分之间均是平滑的曲线过渡（线性梯度部分以及一段梯度升高后维持直线，每两段之间为平滑曲线过度）。

图9的示例显示了在约25％、50％和75％B的线性（箭头）条件下，空白梯度运行呈现有规律的偏移。

图8. 图9显示了HPLC系统的梯度阶梯测试结果。（a）0、10、20、30、40、45、50、55、60、70、80、90和100％B的梯级；（b）以1％的梯级向上跟踪至45-55％。箭头显示了50和51％之间的“较短”梯级。来源[4]。

与这些条件相对应的阶梯测试如图8a所示，并且在这个度量（放大比例）下表现良好。

为了更仔细地检查问题区域，在45-55％B范围内以1％的增量进行阶梯测试，如图8b所示。

这个扩展（放大）图清楚地显示了在50％和51％之间的梯级中，存在不规则性。

在线性图中的定期（有规律间隔的）误差（图9）表明，控制比例阀的算法或比例阀本身存在问题。

在目前的情况下，调整控制（控制软件）软件无法解决问题，因此应更换比例阀，以解决问题（因此更换了比例阀，问题被解决）。

图9. 故障比例阀线性梯度图。箭头显示线性偏离；绘制下面的虚线以供参考（虚线为标准参考线）。以1mL/min的速度运行梯度0-100％B 15分钟；A =水、B = 0.1％丙酮水溶液；检测UV 265nm。来源[4]。

尽管可以假设单一来源是导致特定HPLC问题的原因（虽然通常可以假定某HPLC问题只有一个故障原因），但情况并非总是如此。

图10a显示了以非常浅的梯度（30分钟内19-24％ACN）连续三次注射肽样品的结果（显示了一种多肽样品三次连续进样，窄梯度洗脱（30分钟内19-24%乙腈梯度洗脱））。

由于怀疑存在流量（流速）问题，因此在双活塞双泵系统中更换了所有8个止回阀（单向阀）和4个泵密封件（圈）。

这大大改善了保留变量（保留时间大为改善），保留范围从2.1分钟变化到1.0分钟（图10b），但仍然是（此偏差仍）不可接受的。

为了进一步研究问题，将溶剂预混合到装有15% ACN的A容器和装有25％ACN的B容器中（在A瓶中预混合15% 乙腈，在B瓶中预混合25% 乙腈）。

当调整仪器设置以产生与图10a和b相同的梯度时，获得图10c所示的结果。尽管仪器的配比精度在±0.1％的规格范围内，但对于非常浅（窄）的梯度来说仍是不够的。

预混合溶剂将有效精度从0.1％提高至0.01％，如果该样品希望具有令人满意的保留时间再现性，这点是必需的。

预混合可以提高系统性能，以满足苛刻的分离要求。

图10.三次连续注射肽样品的扩充（放大）色谱图。产生的色谱图：（a）使用原始系统配置（b）更换所有止回阀（单向阀）和泵密封件（圈）后（c）使用预混流动相。色谱柱：250×4.6mm、5mC18以1.5mL/min和35℃运行，并在215nm检测。梯度：30分钟内19-24％ACN / 0.1％TFA的水溶液。来源[5]。

水平和垂直电泳仪作为电泳仪市场当中的使用Z为广泛的电泳仪，其优势是十分明显的，选择嘉鹏牌电泳仪，对于实验室各种实验的开展而言十分有意义。

一、电泳仪的使用方法：

1、首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意极性不要接反。

2、电泳仪电源开关调至关的位置，电压旋钮转到Z小，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。

3、接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止，设定电泳终止时间，此时电泳即开始进行。

4、工作完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拨出电泳插头。

二、 电泳仪的注意事项：

1. 电泳仪通电后，禁止人体接触电极、电泳物及其它可能带电部分，也不能到电泳槽内取放东西。如需要应先断电，以免触电。同时要求仪器必须有良好接地端，以防漏电。

2. 仪器通电后，不要随时增加或拨掉输出导线插头，以防短路现象发生，虽然仪器内部附设有保险丝，但短路现象仍有可能导致仪器损坏。

3. 由于不同介质支持物的电阻值不同，电泳时所通过的电流量也不同，其电泳动速度及电泳至终点所需时间也不同，故不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。

4. 在总电流不超过仪器额定电流时(*大电流范围)，可以多槽关联使用，但要注意不能超载，否则容易影响仪器寿命。

5. 某些特殊情况下需检查仪器电泳输入情况时，允许在稳压状态下空载开机，但在稳流状态下必须先接好负载再开机，否则电压表指针将大幅度跳动，容易造成不必要的人为机器损坏。

6. 使用过程中发现异常现象，如较大噪音、放电或异常气味，须立即切断电源，进行检修，以免发生意外事故。 

电泳仪作为实验室的必备实验设备之一，是一种十分精密的仪器，因而在操作的过程当中也要严格遵守操作规程，避免相关故障的发展。但是在电泳仪的使用过程当中，发生相关的故障是必不可少的，此时就需要对这些故障及时的进行处理。 

三、电泳仪可能出现的四大故障及解决方法：

1. 电泳仪的输出达不到设定值

如果电泳仪的输出电压达不到预置值，应首先观察电流或功率是否已经恒定，或者已经达到电泳仪所规定的Z大电流或功率（电泳仪均有明确指示灯标志）。如果尚未达到极限值，将已经恒定电流或功率的设置调大（有必要的话至极限值），才能够提高电压输出。

（1）如果电泳仪的电流达不到预置值，可调整电压或功率。

（2）如果电泳仪的功率达不到预置值，可调整电压或电流。

2. 电脑控制电泳仪过压报警

（1）检查是否空载使用。

（2）是否电泳槽未加缓冲液。

（3）是否电泳槽铂金丝断。

3. 过流保护

（1）是否存在电泳槽短路现象。

（2）缓冲液是否选错。

4. 漏电保护

（1）是否有液体溅入仪器内部或输出接口上。

（2）是否有很多灰尘落入仪器内部。

（来源：上海嘉鹏科技有限公司）