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  jmbmbmbmbm 2017-04-17 00:00:00

  具有平末端或5;-突出末端的双链线性DNA可作为体外转录模板。线性化的质粒DNA、PCR产物或cDNA只要含有双链RNA聚合酶启动子且方向正确均可用作转录模板。 不同RNA聚合酶的同源启动子序列： T7 TAATACGACTCACTATA (+1)GGG T3 AATTAACCCTCACTAAA (+1)GGG SP6 ATTTAGGTGACACTATA (+1)GAA G (+1)是RNA转录的起始位点正义还是反义RNA转录产物的合成依赖于启动子的方向(相对于目标序列)。正义RNA合成要求目标序列置于启动子的下游，而反义RNA的合成则恰好相反。 质粒模板 质量 质粒DNA的质量影响转录产量和合成RNA的完整性。Z高纯度的质粒模板可获Z大的转录产量。常规实验方法纯化的DNA如果没有RNases、SDS、EDTA、蛋白质、盐类* 和RNA污染即可用作转录的模板。转录用DNA模板A260/280比值应在1.8-2.0之间。GeneJET8482; Plasmid Miniprep Kit (K0502)可制备高纯度的转录用DNA。 * 当NaCl或KCl的浓度超过150 mM时，T7和SP6 RNA聚合酶的活性~50%被YZ；当NaCl或KCl的浓度超过250 mM时，T3 RNA聚合酶的活性~50%被YZ。 线性化 如需获得特定长度的RNA转录产物，可在插入位点下游选择合适的限制酶(切割产生平末端或5’-突出末端为佳)切割质粒DNA使之线性化。有报道指出3’-突出末端可能会引起错误转录(1)，应尽量避免。3’-突出末端可在转录前经T4 DNA聚合酶(EP0061)处理平端化。 由于RNA聚合酶具有很高的持续合成能力，环状质粒模板转录产生不同种类长片段RNA转录子的产量比线性质粒模板高。因此质粒彻底线性化对确保有效合成特定长度转录产物非常重要。如果不能彻底酶切，转录前可考虑凝胶回收(如DNA Gel Extraction Kit (K0513))线性化DNA。线性化后，酚/氯仿抽提纯化DNA模板： （1）加入1/10体积3M醋酸钠溶液(R1181)到DNA溶液中。 （2）彻底混匀。 （3）加入等体积酚/氯仿混合物(1:1比例)抽提后再用等体积氯仿抽提两次。收集水相转移至新离心管。 （4）加入2倍体积乙醇沉淀DNA，-20°C静置至少30分钟，离心收集沉淀。 （5）弃上清，加入500 μl 70%冰乙醇漂洗沉淀。 （6）加入20 μl DEPC处理水(R0601)重悬DNA。 PCR模板 PCR产物可作为体外转录模板。RNA聚合酶启动子要求定位在待转录序列的上游。 常规体外转录 采用以下操作方法可从1 μg DNA模板中制备10 μg RNA转录产物。反应体系可以放大或缩小。如需高产量转录制备多达200 μg的RNA转录子，请选用TranscriptAid8482; T7 High Yield Transcription Kit (K0441)。 解冻冻存的试剂，混匀后短暂离心。 酶蛋白和核苷酸需冰上放置。 反应缓冲液需室温放置。 1 室温配制以下反应体系： 5X 转录缓冲液 10 181;l ATP/GTP/CTP/UTP Mix， 10 mM each 10 181;l (终浓度2 mM) 线性化模板DNA 1 181;g RiboLock8482; RNase Inhibitor 1.25 181;l (50 u) T7 RNA Polymerase（点击黄颜色查看产品详情） 或T3 RNA Polymerase 或SP6 RNA Polymerase 1.5 181;l (30 u) DEPC处理水 (R0601) 至 50 181;l 总体积 50 181;l 2 37°C孵育2小时。 3 可选：加入2 μl (2 u) DNase I， RNase-free (EN0521)，混匀后37°C孵育15分钟除去DNA模板。 4 加入2 μl 0.5 M EDTA， pH 8.0 (R1021)，65°C孵育10分钟终止反应。 备注 无螯合剂存在时，加热会导致RNA的水解

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