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- 姐姐是魔鬼 2016-12-20 00:00:00
- 对于某些用途(例如用BAL31进生活化或用T4噬菌体多核苷酸激酥标记质粒DNA的限制切片段的5'端),必须获得无RNA污染的DNA制品。尽管在通过氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心所制备的质粒DNA中,这样的RNA污染物的质量已很少,但其中的RNA分子数仍可能相当可观,并可在限制酶消化反应的全部5'端中占据较大的比例。通过下述方法,可以从质粒制品中去除RNA。通过Bio-Gel A-150m或Sepharose CL-4B进行层析 1、 制备质粒DNA。 2、 有等体积的经TE(pH8.0)平衡后的酚抽提1次。 3、 将至多1ml的水相铺在经TE(pH8.0)和0.1%SDS平衡的Bio-Gel A-150m或Sepharase CL-4B(1x10cm)柱上。 4、 将DNA装入层柱并在柱的上部连接上含0.1%SDS的TE(pH8.0)的贮液瓶,立即开始以0.5ml流出液为1流进行收集。 5、 当收集到15份时,关闭柱底部,为明确质粒DNA的分布情况,可在每份收集物中取10μg样品,通过0.7%琼脂糖凝胶电泳或溴化乙锭荧光进行分析。 6、 将含质粒DNA的组成合并在一起,加2倍体积的乙醇于4℃沉淀10min,然后以4℃大于10 000rpm离心15min,以回收DNA。
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实时荧光定量PCR技术是通过测定RNA的转录水平来评估基因的活力。RNA样本提取的质量直接影响基因表达分析。影响RNA品质的因素有以下三种:RNA浓度、RNA纯度和RNA完整性。
检测RNA浓度、纯度和完整性的方式主要有以下几种:
紫外分光光度计法:
测量260nm吸收值计算RNA浓度,测量260nm/280nm吸收值的比值,用于评估RNA纯度。需要注意的是:在检测核酸物质时应该在固定的PH溶液中进行。
260nm/280nm的比值范围在 1.9~2.1 之间。<1.9,说明有蛋白质残留;>2.1,说明RNA可能发生降解。
琼脂糖凝胶电泳:
完整的RNA通常有三条带,最亮的是28S条带,其次是18S条带,最淡的是5S条带(部分试剂盒提取时会过滤掉5S条带)。通过琼脂糖凝胶电泳可以检测28S和18S的比值。该方法主要用于检测RNA的纯度和完整性。
如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利,28S的亮度在18S条带的两倍以上,我们认为RNA的质量好。
若RNA条带出现弥散,原因可能:RNA被核酸酶降解、电压或电流过大、上样量过高或过低等。
上述两种方法在实验室比较常用,此外还有几种检测方式供大家选择。
荧光染料检测:
通过荧光染料和RNA结合,荧光活性增强。此方法的灵敏度较高,主要用于检测RNA的浓度。
微毛细管电泳:
可使用软件的RIN(RNA Integrity Number)分数评估,10为RNA完整性好,0为最差。此方法的灵敏度和分辨率较高,可用于检测RNA浓度、纯度和完整性。
3’-5’完整性检测:
是在一个RNA样本中检测GAPDH mRNA的完整性来代表所有RNA的完整性,主要用于检测RNA的完整性。
得到高品质RNA的小建议:
1、尽量避免RNA酶污染,使用无RNA酶的耗材和试剂,建议将扩增前后的场所分开。
2、尽量减少采样时间,样品处理后快速冷冻,可以加入RNA保护剂。
3、RNA提取过程中可以使用RNA酶YZ剂。
4、存储过程中避免反复冻融。
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