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前言
MIQE是描述评估qPCR实验所需的最小信息,该指南是稿件投稿时需要同时提交的一个清单。通过作者提供相关的实验条件和实验特点,审稿人可以评价实验所用方法的可靠性。另外提供详细的实验所用试剂、序列和分析方法,其他研究人员可以利用这些信息进行重复实验。
对于核酸提取MIQE有明确要求两点——实验组与对照组的定义及每一组的样本数量。
无论采用手工法还是试剂盒,只要符合MIQE的要求并实现良好的可操作性和重现性,就是合理客观的技术方法。MIQE在该部分操作中的要求又分为两大块——样本描述和核酸提取方法。
样本描述
▶ 样本采集和处理的方法描述
▶ 样本的来源描述(宏观解剖还是激光显微切割)
▶ 样本是如何即时处理(保存条件及时间)
▶ 冷冻样本的冷冻方法和时间
核酸提取
采取的提取方法:
1)手工法:小批量经济型
2)自动化仪器:大批量高效型
按获取的物质可分为DNA和RNA:
◆ DNA:适合拷贝数变异、SNP分析等实验
◆ RNA:适合基因表达、长非编码RNA等实验
图源:网络,侵删
按提取方法分为化学法和机械破碎法:
◆ 化学法:适合采用碱裂解法的样本,质粒提取、菌类的提取
◆ 机械破碎法:比较坚硬有一定韧性的物质,动植物组织
更推荐使用合适的商品化的核酸提取试剂盒,流程标准化程度更高,质量更容易得到保证,这样在方法描述时可以更简单一些,直接引用试剂盒的生产厂家、货号和名称即可。
DNA酶或RNA酶的处理细节:
基因表达实验中,RNA模板如果存在DNA污染,会严重干扰最后的结果。因此提取RNA时要加入DNA酶将DNA消化掉,工作浓度、处理温度和时间要加以说明,同时也要加入RNase抑制剂提供保护。使用柱纯化试剂盒提取RNA时也可以在柱上进行DNA消化。同样的,提取DNA时也要将RNA消化掉,尽管残留RNA对DNA为模板的qPCR实验影响小得多。
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