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       寻求改进质量和提GX率的药品生产商对使用 Sievers*总有机碳（TOC）分析仪进行清洁验证的兴趣越来越浓。大多数制药或生物科技厂家目前都配有 TOC 分析仪以符合美国药典USP、ZG药典 ChP的水检测要求，以放行纯化水或注射用水用于清洁或生产过程。因此，大多数厂家已经拥有用于清洁验证的TOC测定方法。 

       TOC 是 FDA 认可的一种方法¹，用于评估所给样品中 所有含碳的化合物，以确保所有设备 的清洁都符合所建立的清洁标准。TOC分析允许开发一种方法， 用于检测由化合物、分析物或残留物通过直接（擦 拭）或间接（冲洗）取样而形成的碳浓度。潜在目 标残留物包括药物活性成分（API）、药品赋形剂、 蛋白质、蛋白质副产品和清洁剂或成分。 

       1996年，国际协调会议（ICH）在FDA（CDER &  CBER²）的协助下，创建了指导文件《Q2B；分析 步骤的验证》。本文档的目的是为制药公司提供指导，以考虑用于清洁验证的分析方法验证中的具体特征。此应用说明提供了与下列参数相关的多个实例，这些实例均与 TOC 方法验证有关，因而此应用说明呼应了Q2B指导文件： 

• 检出限和定量限 

• 确定分析物的准确度和精确度 

• 线性和回收百分比验证 

• 分析方法的稳固性³

检出限和定量限 

       ^{检出限（LOD）用于评估何时信号是仪器噪音的结果还是化合物的反应。LOD被视为样本中分析物的 Z低检测量，但没有必要的足够的统计确定性来定量。定量限（LOQ）是对数据有意义还是无意义提供指 导而建立的值。}

       低于 LOQ 的仪器反应表示存在有机物，但无法定量实际浓度。分析仪中的读数高于已建立的 LOQ 则被视为可定量或有意义的数据。

       为了确定背景 TOC 的浓度并推导出用于清洁验证方案的 LOD 和 LOQ，必须准备低 TOC 的水空白或棉签空白（如果适用）来计算实验中水和小瓶的碳成分。 一旦已经从这些样本中确定了标准偏差，则通常是将标准偏差分别乘以3和10来获得 LOD 和 LOQ⁴。

确定分析物的准确度和精确度 

       了解 TOC 分析方法验证中准确度和精确度的区别非常重要。准确度与测得值和分析物的真实值的接近 程度相关。通常，准确度是计算仪器验证时测得的标准品的 TOC 浓度与预期的标准品 TOC 浓度的差值百分比（即+7%）所得。 

       精确度通过标准偏差或 RSD（变异系数）度量。精确度与所给样本的多个分析结果相互之间的接近程 度相关。 

       在 TOC 方法验证期间，通过分析加了（添加）已知 浓度的目标残留物的样品可以测定准确度和精确度， 并可以评定差值百分比和 RSD。ICH 文件推荐至少在三个浓度级别上至少进行九次测定来评估准确度 和精确度，这三个浓度级别涵盖了仪器的指定范围 ⁵。

线性和回收百分比验证 

       通常，线性测试校验仪器反应值是否与所研究分析 物的浓度具有线性关系。图1演示了TOC浓度范围 从 1.00 ppm到 7.50 ppm，牛血清白蛋白（BSA）的 线性关系，其中含低TOC水的小瓶中加了已知浓度 的 BSA 。这个例子演示了理论浓度（x轴）对所测得的浓度（y轴）作图所得到的两者之间的线性关系，y=(m)x+b。分析仪的反应值与所研究化合物的相关系数（R2）应大于0.97。

       为了确定TOC方法用于分析目标残留物的适用性， 有必要确定分析方法可达到的回收率。以下例子使用 CIP-100 制备已知 TOC 度的溶液，并将已知量的样本放到不锈钢片上，演示了直接取样方法。在BSA的例子中，在不锈钢片上添加三个递增浓度的 CIP-100 清洁液，擦拭不锈钢片，然后将此棉签放到已知量的低TOC水中。表 1 提供了从不锈钢片表面获得的回收百分比结果。

分析方法的稳固性 

       与实际回收率同样重要的是，用于确定所研究化合物回收百分比的 TOC 分析方法的重现性或稳健性。 在清洁验证方法开发中稳固性是指结果不受方法中参数、或样本之间的小而微妙的变化的影响的能力。 还提供了正常使用期间的可靠性指示（例如各个分 析员的取样方法）。若希望得到高回收率，回收率一直保持可重复性也同等重要或更为重要，并在整 个方法开发期间一直需要对回收率进行检测。表 1 和表 2 提供了CIP-100 棉签回收率分析信息，由两个不同的分析员测试样本间的变化。

要考虑的Z后几点

评估制药产品质量水平的测试步骤要遵从各项要求。具体到清洁验证来说，当前的药品生产质量管理规范［21 CFR 211.194(a)] 要求，用于评估药品是否符合已建立规范的测试方法必须满足准确度和可靠性的合适标准7。同时考虑到分析方法的验证是通过实验室研究建立的过程，本应用说明中说明的（TOC）方法的性能特征满足计划进行的分析应用的某些要求，例如符合药典的水排放和清洁验证。

参考文献

1. FDA网站：www.fda.gov/cder/guidance/cGMPs/equipmenthtm。

2. 药品评估与研究ZX（CDER）和生物制品评估和研究ZX（CBER)。

3. Guidance for industry Q2B: Validation of Analytical Procedures. Methodology. November 1996. ICH, FDA, CDER, CBER. 

4. Taylor, John K. Quality Assurance of Chemical Measurements. Lewis Publishers imprint of CRC Press; 1987. 

5. USP <1225> Validation of Compendial Methods.. 

6. The Swab Recovery Determination of CIP-100 in Solutions by TOC Analysis Using a Sievers TOC Analyzer, Steris Corporation Analytical Method; 1993. 7. 21 CFR 211.194(a) Laboratory Records.

7. 21 CFR 211.194(a) Laboratory Records.

简介
       清洁验证是一个需要具有完备证明文件的过程，证明制药行业生产设备的清洁是有效的和一致的。清洁验证策略的必要性已经要求去寻找一个定量的、精确的方法，确定制药生产过程中的污染物或者清洁残渣是否存在。
测试方法
       当前有两种清洁验证方法需要采用 TOC 分析：棉签技术和清洗水技术。下面是这两个方法的主要叙述。
棉签技术
       棉签技术需要一些棉花，聚酯、聚亚安酯或者 Teflon^®的棉签，采集制药生产罐内部某些区域的样品。这些区域可以是罐的内壁，也可以是一个称作“试样” 的小板（在生产过程中，这个小板悬浮在产品的表面，作为生产用罐清洁和清洗程度的标志物）。棉签放置于要采样的表面，擦拭整个样品表面。 擦拭的方向和压力在清洁标准操作规程（SOP）中作了定义。然后萃取这个采样过的棉签。将棉签放入一个装有酸性溶液的小瓶中，然后执行超声波或者离心处理，Z后分析此酸性溶液的 TOC 浓度。
       也可以通过将棉签放入一个密封的、装有 5%磷酸和 100 克/升过硫酸钠溶液的玻璃安瓿瓶中，之后分析这个棉签浸取液。无机碳形式的二氧化碳被吹扫到环境中，然后密封这个玻璃瓶。玻璃瓶被加热到100℃并保存指定的时间。Z终，打开玻璃瓶， TOC 以二氧化碳的形式被吹出并进行检测。
清洗水方法
       这个过程包括：在产品生产之前分析取自设备的清洗水，然后在清洁和清洗了生产设备之后再次分析这个清洗水。比较两次的分析结果以证实设备的清洁度。
清洁验证中TOC分析的优势
       TOC 分析具有检测原材料、生物制品、清洗物质、清洁剂和其它有机污染物等很多应用场合。 TOC的结果是重复的以及定量的，并且不会受到特定物质的干扰。这使 TOC 的结果能够被快速地进行准确无误的验证。
结论
       通过快速和准确的分析， TOC 分析仪能够检测制药行业生产水中大量的有机污染物。在 TOC 分析的广泛的应用中，OST 和清洁验证只是其中的两项应用。随着法规条例的不断补充， TOC 分析像其它方法和技术一样，其重要性将不断地提高。虽然如此，需要做更多的研究，使 TOC 的分析在制药行业发挥Z大的效率。

寻求改进质量和提GX率的药品生产商对使用Sievers®总有机碳（TOC）分析仪进行清洁验证的兴趣越来越浓。大多数制药或生物科技厂家目前都配有TOC分析仪以符合美国药典USP、ZG药典ChP的水检测要求，以放行纯化水或注射用水用于清洁或生产过程。因此，大多数厂家已经拥有用于清洁验证的TOC测定方法。

TOC是FDA认可的一种方法➀，用于评估所给样品中所有含碳的化合物，以确保所有设备的清洁都符合所建立的清洁标准。TOC分析允许开发一种方法，用于检测由化合物、分析物或残留物通过直接（擦拭）或间接（冲洗）取样而形成的碳浓度。潜在目标残留物包括药物活性成分（API）、药品赋形剂、蛋白质、蛋白质副产品和清洁剂或成分。

1996年，国际协调会议（ICH）在FDA（CDER & CBER➁）的协助下，创建了指导文件《Q2B：分析步骤的验证》。本文档的目的是为制药公司提供指导，以考虑用于清洁验证的分析方法验证中的具体特征。此应用说明提供了与下列参数相关的多个实例，这些实例均与TOC方法验证有关，因而此应用说明呼应了Q2B指导文件：

■ 检出限和定量限

■ 确定分析物的准确度和精确度

■ 线性和回收百分比

■ 分析方法的稳固性➂

检出限和定量限

检出限（LOD）用于评估何时信号是仪器噪音的结果还是化合物的反应。LOD被视为样本中分析物的ZD检测量，但没有必要的足够的统计确定性来定量。

定量限（LOQ）是对数据有意义还是无意义提供指导而建立的值。低于LOQ的仪器反应表示存在有机物，但无法定量实际浓度。分析仪中的读数高于已建立的LOQ则被视为可定量或有意义的数据。

为了确定背景TOC的浓度并推导出用于清洁验证方案的LOD和LOQ，必须准备低TOC的水空白或棉签空白（如果适用）来计算实验中水和小瓶的碳成分。一旦已经从这些样本中确定了标准偏差，则通常是将标准偏差分别乘以3和10来获得LOD和LOQ➃。

确定分析物的准确度和精确度

了解TOC分析方法验证中准确度和精确度的区别非常重要。准确度与测得值和分析物的真实值的接近程度相关。通常，准确度是计算仪器验证时测得的标准品的TOC浓度与预期的标准品TOC浓度的差值百分比（即+7%）所得。

精确度通过标准偏差或RSD（相对标准偏差）度量。精确度与所给样本的多个分析结果相互之间的接近程度相关。

在TOC方法验证期间，通过分析加了（添加）已知浓度的目标残留物的样品可以测定准确度和精确度，并可以评定差值百分比和RSD。ICH文件推荐至少在三个浓度级别上至少进行九次测定来评估准确度和精确度，这三个浓度级别涵盖了仪器的指定范围➄。

线性和回收百分比验证

通常，线性测试校验仪器反应值是否与所研究分析物的浓度具有线性关系。图1演示了TOC浓度范围从1.00ppm到7.50ppm，牛血清白蛋白（BSA）的线性关系，其中含低TOC水的小瓶中加了已知浓度的BSA。这个例子演示了理论浓度（x轴）对所测得的浓度（y轴）作图所得到的两者之间的线性关系，y=(m)x+b。分析仪的反应值与所研究化合物的相关系数（R2）应大于0.97。

为了确定TOC方法用于分析目标残留物的适用性，有必要确定分析方法可达到的回收率。以下例子使用CIP-100制备已知TOC度的溶液，并将已知量的样本放到不锈钢片上，演示了直接取样方法。在BSA的例子中，在不锈钢片上添加三个递增浓度的CIP-100清洁液，擦拭不锈钢片，然后将此棉签放到已知量的低TOC水中。表1提供了从不锈钢片表面获得的回收百分比结果。

分析方法的稳固性

与实际回收率同样重要的是，用于确定所研究化合物回收百分比的TOC分析方法的重现性或稳健性。在清洁验证方法开发中稳固性是指结果不受方法中参数、或样本之间的小而微妙的变化的影响的能力。还提供了正常使用期间的可靠性指示（例如各个分析员的取样方法）。若希望得到高回收率，回收率一直保持可重复性也同等重要或更为重要，并在整个方法开发期间一直需要对回收率进行检测。表1和表2提供了CIP-100棉签回收率分析信息，由两个不同的分析员测试样本间的变化。

要考虑的ZH几点

评估制药产品质量水平的测试步骤要遵从各项要求。具体到清洁验证来说，当前的药品生产质量管理规范［21 CFR 211.194(a)] 要求，用于评估药品是否符合已建立规范的测试方法必须满足准确度和可靠性的合适标准➆。

同时考虑到分析方法的验证是通过实验室研究建立的过程，本应用说明中说明的（TOC）方法的性能特征满足计划进行的分析应用的某些要求，例如符合药典的水排放和清洁验证。

参考文献

➀.FDA网站：www.fda.gov/cder/guidance/cGMPs/equipmenthtm。

➁.药品评估与研究ZX（CDER）和生物制品评估和研究ZX（CBER)。

➂.Guidance for industry Q2B: Validation of Analytical Procedures. Methodology. November 1996. ICH, FDA, CDER, CBER.

➃.Taylor, John K. Quality Assurance of Chemical Measurements. Lewis Publishers imprint of CRC Press; 1987.

➄.USP <1225> Validation of Compendial Methods..

➅.The Swab Recovery Determination of CIP-100 in Solutions by TOC Analysis Using a Sievers TOC Analyzer, Steris Corporation Analytical Method; 1993. 7. 21 CFR 211.194(a) Laboratory Records.

➆.21 CFR 211.194(a) Laboratory Records.

清洁验证是目前生物制药行业不可缺少的重要环节，对于安全规范质量生产的重要性不言而喻。

　　与传统的HPLC方法相比较，TOC法的灵敏度更高，对于少数不溶于水的有机化合物也能检测到。而且验证过程简单方便，无需设置其他参数，而目前被广泛应用于清洁验证。

　　TOC取样验证棉签是一种专门用于检测水质和制药设备表面残留物的工具。它可以检测出水中的总有机碳(TOC)含量，以及设备表面的有机物和无机物的残留量。这些残留物可能会影响生产过程中的水质和产品的质量和纯度，因此需要进行定期的检测和验证。

　　深圳美迪科生物一次性TOC取样拭子棉签助力清洁验证

　　TOC验证取样棉签通常使用无纺布材料制成，具有低离子、低粒子和低缩水性等特点，能够有效地避免交叉污染和产生误差。其操作简单、快速，可靠性高，因此在生物制药行业中得到广泛应用。

　　棉签的头是100%的连续聚酯纤维材质制作，头部直接加热模塑于聚丙烯手柄上，优于传统的棉签;

　　总有机碳含量 <50 µg/L, <50 ppb, 保障拭子本身不干扰测试数据;

　　双层、双层编织涤纶头，可夹带污染物;在抽样过程中的针织结构。这是最大限度地采样收集并释放到稀释剂中，以提供优良的回收率;

　　带缺口的分离式手柄，可将头部放入最小处理和采样的小瓶;

　　100%聚丙烯手柄，确保无其他污染物，具有优异的耐化学性。

在现代的科学研究、生产和实验室工作中，洁净度和准确性至关重要。针对TOC(总有机碳)验证的特殊需求，美迪科推出了TOC清洁验证棉签MPS-713。这款棉签具有极强的耐磨性和锁紧性能，为清洁验证工作提供了极大的便利和可靠性。

　　该棉签的特点之一是其洁净室水洗设计。它采用双层针织涤纶材料制成，不含硅、氨和邻苯二甲酸二辛酯(DOP)，确保了高度的洁净度。无论是微生物取样还是纯化水的TOC取样，这款棉签都是专门为清洁验证而设计的，可满足各种验证要求。

　　手柄采用浅绿色的聚丙烯材料制成，具有良好的耐化学性和抗溶剂锁紧能力。同时，手柄设计合理，易于折断，方便取样后的处理和保存。热粘合头的设计使棉签柔软无磨损，并且具有超低的不挥发物残留和低颗粒纤维生成，确保了取样的准确性和可靠性。

　　除了优异的性能特点，美迪科TOC清洁验证棉签还注重产品的生产工艺和包装环节。它在100级洁净区内进行全程生产和包装，极大地降低了发尘量，确保了产品的洁净度。

　　美迪科TOC清洁验证棉签的结构特点也非常值得一提。它的清洁头采用针织涤纶材质制成，具有干净耐磨的特性，可用于清洁验证工作的各个环节。拭子手柄采用刚性设计，并配备大型内部头部桨叶，提供了坚实的支撑，使棉签在使用过程中更加稳定和可靠。手柄还带有折断点，方便处理和保存样本，增加了工作效率。

　　综上所述，美迪科TOC清洁验证棉签MPS-713是一款针对清洁验证工作而设计的专用棉签，具有强的耐磨性和锁紧性能。它采用洁净室水洗设计，不含有害物质，拥有良好的耐化学性和溶剂锁紧能力。该棉签在生产工艺和包装环节也经过精心设计，确保产品的洁净度。无论是用于微生物取样还是TOC取样，美迪科TOC清洁验证棉签都是您可靠的选择。

确定最适合您的机会和挑战

制药企业不断面临进行清洁验证的挑战。以下是确保实施成功、合规清洁验证的五种方法。

01  为您的清洁程序确定合适的技术和最有效的部署方案（实验室、在线、旁线）

了解您的清洁过程。为清洁过程选择正确的技术是成功实施清洁验证的关键。对于清洁验证，有许多常用的分析方法。

 专属性方法 

如在清洁过程中对特定分析物进行UV/VIS或HPLC试验。尽管可以对目标分析物进行检测并使人们确信目标分析物已经清洗干净，但这些测试无法检测到可能影响产品质量、产量、效能或安全的其它化合物，如降解物或洗涤剂。这种类型的分析仅限于在实验室使用。

 非专属性方法 

如总有机碳TOC分析法，与专属性方法相比，可对清洁度有更全面的了解。TOC法不只是检测一种分析物，而是通过采用一种方法来检测清洁剂、降解物、API和赋形剂。TOC还可根据您的工艺提供多种ZJ部署方案（实验室、在线、旁线）。

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02  简化方法验证和仪器确认

需要进行方法验证和仪器确认，以表明方法参数适当，并且仪器适用于该方法。尽管这些对于清洁程序的成功与否至关重要，但方法验证和仪器确认并不一定非得很复杂。

开发一种合适的方法来提供充分的化合物回收率、线性、稳固性和专属性数据，并设定合适的接受标准。重要的是要证明这些分析数据满足要求，并确保所选择的技术能够满足可靠的方法开发需求。方法开发和验证应本着实用性、可实现、可验证并具有说服性原则。

对仪器进行全面确认，以验证仪器的安装、操作和性能满足其预定的用途要求。一些仪器制造商会提供相关文件和服务来协助您全面完成仪器确认工作。

03  选择ZJ消耗品，以实现ZJ回收率和样品可靠性

样品瓶和标准品等消耗品会对分析方法的成败产生极大影响。请确保您为清洁工艺选择可追溯、合规和和合适的消耗品。

应该定期对系统进行挑战，以确保方法的适用性。选择浓度合适的一种或多种化合物，以反映您的清洁工艺，并且对清洁验证使用的仪器进行适当的挑战。

一些供应商会提供特殊消耗品，以提高验证方法成功实施的概率。例如，如果您的工艺涉及到蛋白质检测，则对TOC样品瓶进行预先酸化可大大提高经常被漏报的粘性蛋白质的回收率。在开发检测方法时，请考虑此类解决方案。

在线分析相较于实验室分析，可以降低使用样品瓶的成本并提高样品的可靠性。自动化分析在一定程度上消除了取样误差，同时节省了金钱和时间。

04  利用数据来控制、深入了解和优化清洁工艺

选择能够生成可信、可验证并用于故障排除和重要CGMP决策数据的技术。如果数据没有经过验证且不准确，就很难深入了解和控制清洁工艺。

拥有准确的数据可以使人们对结果充满信心，并以此做出重大质量决策。如果采用TOC，在选择具体TOC技术进行清洁验证时应格外小心，因为某些技术不适合用于精确分离和检测。

TOC分析仪提供了可以洞悉清洁工艺的三个单独的数据，以ZZ实现对清洁工艺的控制、深入了解和优化。一个样品分析可以给出无机碳、总有机碳和电导率数据。通过这些数据可用于确定清洁工艺失败的根本原因，采取纠正和预防措施或优化清洁周期。

05  数据可靠性

在CGMP设置中，数据可靠性比以往任何时候都重要，在清洁验证中实施分析技术时必须考虑数据可靠性。

FDA已经对采用相关分析方法时不遵守数据可靠性标准多次发出了警告函。具体来说，当采用HPLC时，常见的问题是没有对峰值进行积分或没有对鬼峰产生的原因进行调查。在清洁验证中出现未知峰不可避免，但必须对其进行彻底调查并记录。

使用TOC进行清洁验证不仅可以全面了解清洁度，并且一些分析仪还完全符合21 CFR 第11部分规定的要求和数据可靠性准则。数据应保存在安全的数据库中，能够随时访问，所有工作均应保存在安全审核记录中。在利用数据做出重要质量决策时，需要制定和实施强有力的程序来保证数据的可靠性和安全性。

当采用在线TOC分析进行清洁验证时，由于不存在数据转录、打印和未验证数据传输的环节，因此具有更高的数据安全性和可靠性。

01 简介

清洁验证研究和持续的清洁周期监控都需要使用TOC浓度低且稳定的样品瓶来进行灵敏度和可靠性高的擦拭和淋洗样品分析。使用TOC浓度较高且差异较大的清洁验证套装，会增加失败的风险，从而不得不进行额外清洁，或者做出不准确的设备清洁度评估，导致代价高昂甚至危险的后果。

本文评估以下两种不同的清洁验证套装，均包括低TOC棉签和TOC样品瓶:

1. 苏伊士公司的Sievers^®清洁验证套装

2. Texwipe* TX3342 TOC清洁验证批量套装

02 评估

本文评估各供应商的清洁验证套装的基准TOC贡献和差异。在测试中，我们分析了各供应商的两个批次的棉签(每批次12个棉签)，棉签均装在40毫升超纯水的样品瓶中(每个供应商提供12个样品瓶)。两种清洁验证套装均使用Texwipe棉签。

03 基准TOC结果

04 结论和建议

本文中的数据显示，测试的两个批次的Sievers清洁验证套装的背景TOC都比较低而且稳定。此外，在同一批次内，Sievers套装的浓度差异较小(Sievers的两个批次的标准偏差分别为3.3和3.4ppb，Texwipe的同两个批次的标准偏差分别为4.0和6.3ppb)。在不同批次之间，Sievers套装的浓度差异也较小。由于Sievers套装的背景TOC低而且差异小，因而更能提供灵敏而精确的清洁数据。Sievers的高品质保证和样品瓶的完全可追溯性为准确而完整的分析提供了强有力的保障。

在进行清洁验证时，Sievers认证的样品瓶、清洁验证套装、预酸化样品瓶都具有出众的性能和稳定性。如果您需要使用酸化擦拭样品，比如用来回收蛋白质或肽，Sievers给您提供装有酸化水的预酸化样品瓶。无论您是要回收常规化合物还是难以回收的化合物，Sievers认证的和专用的TOC样品瓶都能帮助您完成极其准确的分析。

*Illinois Tool Works Inc的商标

       美国食品药品管理局（FDA）及相关的国际组织， 致力于制定长期法规服务大众，确保药品的效力、 一致性和纯度。当前《优良操作规范（current  Good Manufacturing Practices，cGMPs）》中的法规条例要求生产商按照详细的过程和规范, 来确保产品质量和安全¹。 

       长久以来，医药行业设计清洁验证程序时，都围绕来源于HPLC数据的主观的限值和不切实际的回收 率测试。实际上，很多淋洗样品都只是达到药典对于产品放行的规定，而非设备放行规定。 

       这篇应用文章旨在启发读者，重新思考目前清洁验证中使用的分析方法，并质疑是否在合适的应用中 使用了合适的方法。

当前阶段 

       过去的几十年，其他行业已开始陆续使用因技术发展而产生的过程质控战略，事实证明其更GX，更 有效。但是医药行业却因为各种原因对于这一改进战略的采纳过于缓慢，其中，过程分析技术（PAT） 的监管不确定性就是原因之一。另外，之前对于清洁过程验证的检查指南（1993）被USFDA以外的监察机构，指导性机构（ICH，PIC/s）所广泛采用， 用于指导客户使用一个简单框架或生命周期法来进行清洁过程的验证。 

       然而，Z近业内和监管者同时注意到，使用TOC方法能实现质量的提升和成本的控制，很多制药企业 开始采用非专属性方法进行实时放行，以及清洁过 程控制和生产设备放行。指导文件，如FDA PAT文 档所描述的，及FDA 2011年《过程验证指南》，提 供了如何使用非专属性方法，以符合cGMP关键的 中清洁应用的框架。过程验证指南文档对过程验证 生命周期方法的定义如下：^2.3

期望阶段 

       总有机碳（TOC）是一种关键质量属性（CQA， Critical Quality Attribute），是检测清洁的关键过 程参数（CPP，Critical Process Parameters）的 众多手段之一。依靠定期实验室淋洗或棉签取样的 专属性方法（例如HPLC），与使用已确认、经方法验证并在清洁验证生命周期的各关键步骤使用 TOC仪相比较，前者相对效率低且不可靠。

       但是，这种TOC的应用只能与清洁相关的过程验证 生命周期方法配合使用。在这一应用中每个阶段都 可能影响TOC值。例如，用户需要了解潜在的使用 TOC时所需的各种因素，及其对分析方法产生的影响。

未来阶段 

       要注意到，大部分的药典方法都不是专门为确认持 续过程的分析仪，而预定或设计的。法规的指南建 议用户可考虑将TOC方法作为清洁验证或确认的测 试方法的一种“可替代的分析方法”。1 简单来说， 用户有责任通过规定的方法与工艺验证过程，对其预定的用途，建立分析仪的适用性。 

       除了为清洁过程验证所使用的方法建立系统适用性， 在清洁验证生命周期中还有其他重要步骤需要考虑， 以确保TOC符合cGMP、质量专章与行业指导文件。

步骤如下： 

设计 

• 生产设备的目标用途 

• 清洁剂和Z差情况的化合物 

• 对生产设备的 TOC 取样（棉签或淋洗法） 

• 回收率百分比研究 

• 验收限值或标准（风险评估和工艺产能） 

• 分析仪器确认（USP<1058>） 

• 其他验证方法（ICH Q2r1） 

确认（生产设备） 

• 生产设备的TOC取样（棉签或淋洗法） 

持续确效 

• 生产设备的TOC取样（棉签或淋洗法）

采取行动 

       如之前所述，越来越多的公司正在使用TOC分析进 行清洁验证，因为它更快、更简便，而且比其他分 析方法更经济。TOC方法的样品检测量大，并减少了清洁验证协议实施的时间。即便在生物制药行业 经常遇到的化合物难溶于水，或者含大量蛋白质情 况下，也依旧有效，尽管如果清洁过程的设计是有效的话，这些化合物不应该存在。另外，FDA在检测污染物残留的规章指南中，已经接受了TOC方法。 

       很简单地就可以断定，在清洁验证的生命周期中， 多种化合物必然需要多种分析测试。在多种测试中， 某些意料之外的杂质或清洁剂可能会被忽略，又或者在色谱法分析中出现未知峰。TOC能测出多种目 标化合物，因为它是一种非专属性方法。然而，遵 循以下步骤，以确保成功的转换及正确应用的实施 还是非常重要的：

分析仪器的确认 

       分析仪器确认是一个过程，确保对特定测试使用分析方法是能符合目标用途的。根据cGMP规定，“企 业所使用的检测方法的准确度，灵敏度（检测限）， 专属性和重现性（精确度）必须确立并有文件证 明。”²在这种情况下用TOC法进行清洁过程验证的测试之前，对分析仪器进行严格的确认就尤为重要。 此方法包括由USP<1058>所建议的安装确认、运行确认和性能确认（IQ/OQ/PQ）。

方法和过程验证 

       清洁验证的TOC实施方案通常由四个关键部分组成， 以确保有效、GX地转换为用TOC分析进行清洁过程验证。 

• 回收率（可行性）测试 

       回收率测试或者可行性测试常被作为建议方法，以确定分析物是否适用TOC方法。通常，这种研究只要确定在工艺物料流中，哪种化合物是Z难从设备表面清除的。这一研究的目的是为了论证，设备表面或水溶液中，目标化合物的回收率。研究应该在可控条件下的实验室进行，但应尽可能反映制药生 产中清洁过程的真实情况。

• 方法验证和取样灵敏度测定模板

       规定指出，制药或生物制药企业必须有文件记录的 程序，包含一系列额外进行的对清洁过程方法验证 的测试。这些协议用于证明一个系统或过程（常见 或特殊的），能在可靠的方式及控制中实现其目标用途，生产出的产品能持续满足之前确定的规格。 这些规范采用了ICH Q2r1中提及的验证特性，包括 线性、准确度和精确度。此外，基于直接与间接取 样技术确定灵敏度，是Z好的操作。³ 

• 设备性能确认 

       通常，所有制药处理设备、管路、连接器、玻璃器 皿和备件的自动或手动清洗顺序，都按照同样的工 艺流程，即在Z后的淋洗步骤时采样，并使用经验 证的分析方法进行分析。这个步骤通常会包括TOC、 电导率、内毒素、微生物限度和pH。其他用于设备性能确认的分析包括产品专属性试验。然而，TOC 仅仅是确认生产设备的众多工具之一。^4.5

• 持续确效（日常监控或产品切换） 

       TOC仅仅是清洁过程的验证状态或产品切换时的日常监控的多种手段之一。也有其他独特的方法，在 实验室以外，收集样品，分析TOC，并报告结果或通过/失败标准。若把TOC方法从实验室转换至生产区域，能实时“在使用点“检测，这将是一个有效果且有效率的途径。但是在转换前，必须建立并执行比较性协议。¹

参考文献 

1.FDA网站： www.fda.gov/cder/guidance/cGMPs/equipmen t.htm#TOC 

2. “黄金表格（The Gold Sheet）.” FDC 报告， March 2005 

3. FDA 网站： www.accessdata.fda.gov/scripts/wlcfm/indexd ate.cfm 

4. FDA指导文档：制药质量控制实验室检查指南 （Guide to Inspection of Pharmaceutical  Quality Control Laboratories） 

5. 假设生产设备的日常维护时停产（This  assumes a production shut down for routine  maintenance on manufacturing equipment.） 

6. Andrew W. Walsh 

7. USP <643>总有机碳（Total Organic Carbon）

Q&A

Q1

用于清洁验证的各分析方法有哪些优点？

      用于清洁验证的分析方法可大致分为两类：专属性方法和非专属性方法。

      专属性方法

      专属性方法：仅提供制剂中某一特定成分（通常为活性药物成分（API））相关（或定量）信息的分析方法。

      关键优势在于这些方法可提供有关目标分析物的定量信息。

      非专属性方法包括诸如色谱法（HPLC、UPLC、GC）、光谱法（MS、紫外可见光度计、原子吸收）、 电泳法、ELISA等。

      但是，随着法规要求的不断变化，上面列出的专属性方法无法实现最全面和最合规的监控程序。目前，法规期望清洁验证包括所有潜在污染物的数据，而不仅仅是API。作为监控计划的一部分，应包括活性成分、赋形剂、降解物、清洁剂和洗涤剂。

       当产品的风险程度属于中低并且无法进行目视检查和非专属性测试时，则宜采用专属性方法。

      非专属性方法

      非专属性方法：是指能够提供与整个制剂有关（或定量）信息的分析方法。

      关键优势在于，这些方法可定量给出整个制剂、降解物和清洁剂的定量值，以更全面地了解清洁度。

具体方法包括诸如总有机碳（TOC）、电导率、重量法和pH法等。TOC分析法和电导率分析法是用于清洁验证、确认和监控最常见的非专属性方法。

       与诸如HPLC专属性方法相比，TOC等非专属性方法具有灵敏的检出限（LOD）。TOC分析法提供了更高的灵敏度，同时还可以了解清洁过程的整个情况。TOC分析法对高中低风险产品均适用。

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Q2

在清洁验证程序中仅检测API有什么风险？ 

      API在整个制剂中只占很小的一部分，不一定等同于毒性zui强或zui难清洁处理。因此，检测仅占生产设备内部总成分1/10或1/15的物质具有很大的风险。当采用专属性方法时，可以不检测赋形剂和降解物。

       如果活性成分在清洁过程中降解，使用专属性方法很难对API进行定量检测。例如，降解物可能具有与完整API不同的特性，并且可能不会以相同的特征被洗脱，因此可能检测不到。采用非专属性方法（如TOC分析法），可以定量检测降解物。

Q3

对于当前采用产品专属性方法进行清洁验证（如HPLC分析法）的制造商，向TOC分析法过渡需要哪些步骤？

      首先，需要对目标化合物进行可行性研究，以便采用TOC分析法来确定适当的回收率。这是为了确保TOC分析法适用于利用这些目标化合物来进行清洁验证。接下来，应当按照USP <1225>或ICH Q2（R1）定量法验证指南来对TOC进行量化。ZH，应将产品限值转换为TOC限值，并应考虑回收率。苏伊士Sievers分析仪能够为用户提供大量资源来确保顺利实施上述步骤。

HPLC与TOC

采用TOC分析法进行清洁验证的优势

1.全面了解清洁度

2.更好的了解工艺

3.更快的样品分析

4.更简单的方法开发

5.提GX率，并获得实时数据

Q4

开发用于清洁验证的TOC分析法有多困难，尤其是计算ZD允许残留量（MAC）以及确定最坏情况下的残留物？

       采用Sievers® TOC分析仪可轻松进行分析方法的开发。需要根据样品浓度来确定酸和氧化剂的流量。如果浓度未知，也无需担心 ，Sievers TOC分析仪的自动试剂功能可根据样品基质确保采用正确的酸和氧化剂流量。对于分析过程，这可能会增加一定的时间，但仍比传统的专属性方法要快。

       确定最坏情况下的化合物和进行MAC计算没有任何变化。增加的WY步骤是将ZZ限值乘以最坏情况下化合物的碳百分比，以获得TOC接受标准。

       苏伊士Sievers分析仪的应用专家在指导用户顺利完成从HPLC分析法到TOC分析法过渡方面有着丰富的经验。技术支持包括对TOC限值计算提供帮助以及对可溶和不可溶API方法进行优化。

Q5

TOC分析法可用于检测不溶于水的化合物吗？

       采用TOC分析法需要水性样品溶液。尽管如此，许多认为难以溶解甚至不溶的化合物都可以通过开发出合适的TOC方法来进行检测。对样品进行加热、搅拌或调节样品的pH值可以大大提高化合物的溶解度，以便采用合适的TOC分析法轻松进行检测。作为方法开发的一部分，必须通过运行线性回收率的操作，来证明这些化合物的合适回收率。

Q6

采用TOC分析法可检测哪些类型的洗涤剂或清洁剂？

       TOC分析法通常用于检测许多洗涤剂和清洁剂（包括酸性、碱性或氧化性基质）的痕量残留。可同时采用TOC分析法和电导率法来分析清洁剂的电导率和TOC，以更好地了解离子性的和有机性的清洁度。在苏伊士Sievers分析仪的应用实验室进行的一项研究中，使用Sievers TOC分析仪对CIP 100、CIP 200、碱性和中性清洁剂、杀菌剂以及季铵盐清洁剂进行了分析。所有这些分析提供了多个不同浓度的线性回收率，从而明确了TOC分析法适合于检测残留的清洁剂和去垢剂。

Q7

当采用TOC分析法进行清洁验证时，药品制造商可最快多长时间获取数据并对设备放行做出决策？

      这取决于如何进行分析。传统的“抓取”取样和实验室分析可能很耗时，并且需要几天才能放行设备。对于旁线取样分析，即采用便携式分析仪从工艺取样，可减少工作流程和实验室延迟，从而在数分钟内放行设备。对于采用Sievers TOC分析仪进行在线分析，即分析仪直接与工艺集成在一起，能够实时获得数据并实时放行设备。在标准模式下，每个样品分析本身需要几分钟的时间。如果工艺对分析有时间限制，或需要得到整个清洁过程的概况，可以使用Turbo模式更快地收集数据。在Turbo模式下，每4秒钟就给出一个数据点，从而大大提高了清洁验证程序的效率。

Q8

药品制造商采用TOC分析法进行清洁验证可以在哪些方面获得效率的ZD提升？

       TOC分析法允许制造商在清洁验证程序中采用过程分析技术（PAT）。采用旁线取样分析技术或在线分析技术进行清洁验证可大大提高监控程序的效率。采用PAT技术不仅可以实时提供数据和放行设备，而且可以大大降低取样、分析和人为错误调查所花费的时间。此外，TOC分析法还有助于优化清洁过程本身。采用TOC数据，由于在线清洁验证可以得到工艺概况，则可以降低水、清洁剂的用量，并节省时间。ZH，如在前面问题中所述，采用Turbo模式每4秒钟就可以获取一次数据，这对过程优化有极大的帮助。

简介 

       在生产消费品时，有效地清洁生产设备对质量控制 来说至关重要。清洁工艺的目标是降低产品污染的 风险，有效的清洁工艺可以将风险降低到可接受的 水平，以确保产品质量。如果无法衡量和验证清洁 工艺的有效性，就无法了解产品质量和消费者安全 的风险。 

       根据美国食品和药品管理局（FDA）提供的数据， 2017 年食品和饮料行业产品召回的主要原因是微 生物对产品的污染。对于减少和消除微生物污染来说，强有力的清洁工艺至关重要，因此监控清洁工 艺有效性的方法同样至关重要。  

       总有机碳（TOC）分析是消费品生产商广泛采用的非专属方法，用于检测产品、清洁剂、以及微生物 等污染物的残留量。 

       为了证明 TOC 分析法适用于预期用途，我们对设 备清洁之后可能尚存的残留物进行了回收和线性研究。工厂通常会测试化学污染物和化合物，但很少用 TOC 分析法来测试微生物的回收率。本文旨在探讨对于清洁验证和确认，TOC 分析法能否证明 可接受的微生物污染回收率和线性。

实验设计和设置 

       我们同科罗拉多大学博尔德分校合作，用一整夜时 间在胰酶大豆肉汤中培养 100 毫升枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis）。以 4500 转/分钟的速度将Z 终培养物的十毫升等分试样离心分离 10 分钟，形 成细胞沉淀。 在每次离心之间，倒出上面的液体，用涡旋混合方 法用 10 毫升超纯水使沉淀细胞重新悬浮。重复此 过程 7 次。设计淋洗循环以除去细胞培养基带来的 TOC 污染。在第 7 次淋洗循环后，根据已有的 4,6- 二氨基 -2- 苯 基 吲 哚 （ 4,6-diaminidino-2-phenylindole，DAPI）染色任务来对细胞进行重 新悬浮、稀释、计数（见图 1）。 

       确定细胞密度之后，用 Sievers* M9 TOC 分析仪 测量 1 ppm 确认标样组，然后进行三次细胞浓度 稀释。在测量 TOC 之后，用 0.45μm 灭菌过滤器 过滤剩余样品，彻底除去细菌（见图 2）。然后 再次测量 TOC 以确定每个样品的非细胞背景 TOC（见图 2）。

图 1： 枯草芽孢杆菌在细胞计数的荧光显微镜成像

图 2：枯草芽孢杆菌的过滤过程

结果

表 1：微生物细胞密度与 TOC 的相关性结果

       表 1 和图 3 是微生物 TOC 相关性研究的结果。线性趋势线的 R2 值为 0.9981，表明实测细胞密度有良好的线性趋势。根据图 3 所示的线性拟合趋势线方程，定义为 3 倍噪声的检测水平（LOD，Level  of Detection）为 2.74E + 06 细胞/mL。此外，根据线性拟合趋势线和 M9 仪器规格，50 ppm 的Z 大仪器定量限为 2.49E + 08 细胞/mL。 

       在进行微生物 TOC 定量之后，分别将 1 毫升的每 种细胞密度溶液放在不锈钢试样板上进行试样污染， 然后使试样干燥。此试样污染的目的是确定微生物 TOC 相关结果的目视检测限。图 4 是微生物试样 污染图。

图 3：微生物细胞密度与 TOC 的线性关系

图 4：微生物试样板污染 (A) 5.8E+07 细胞/mL (B) 5.8E+06 细胞/mL (C) 5.8E+05 细胞/mL

讨论与结论

       微生物 TOC 相关结果和试样污染图都说明了连续 监测已有的清洁工艺有效性的重要性。在理想光线 下，很容易在试样板上看到Z 高细胞密度（5.8E +  07 细胞/mL）的污染斑。而对于较低细胞密度， 即使光线很好，也很难在试样板上看到污染斑。这表明除了强有力的清洁工艺之外，还需要用非目测的方法来测试清洁工艺的有效性。 

       根据收集的数据，可以想象用于生产消费品的设备上仍有显着微生物污染，却仅凭目视检查就被投放 到生产中，导致严重后果。因此必须连续监测已有 的清洁工艺的有效性，才能降低产品质量风险和消 费者安全风险。 

       Z 后，由于微生物分子组成的不确定性，很难确定微生物溶液的回收率。本研究根据先前在确定活性 微生物细胞中的碳含量时的发现，旨在确定微生物 溶液的理论回收率。图 5 是理论微生物 TOC 产出 量的计算过程。基于每个细胞的碳原子参考数， 5.8E + 07 细胞/mL 的理论 TOC 浓度为 11.6 ppm。

图 5：理论微生物 TOC 产出量的维度分析

      在本文的实验中，测量到 5.8E + 07 细胞/mL 的 TOC 实际回收值为 9.13 ppm，对挑战性的化合 物的回收率为 78.7％，从而证明实验方法是成功的。 

       总之，本研究用 Sievers M9 TOC 分析仪演示了 在清洁验证和确认时的细胞密度同目视检测限的 关系，成功地证实了微生物 TOC 回收率。实验 数据支持使用 Sievers TOC 分析仪来确认设备清 洁度，同时表明除了目视检查之外还须考虑使用 监测微生物污染的定量方法。 TOC 分析法是测 量残留物、监测清洁工艺、降低总体风险的有效 方法。苏伊士公司提供 Sievers 系列产品，包括 能够解决您的一切清洁验证和确认需求的 TOC 解决方案、服务、支持。

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目的

       为表明Sievers* 总有机碳（TOC）分析仪，对具有高分子量与复杂化学结构的化合物的回收能力，本研究中的这些化合物，通常被认为难于被非燃烧/红外检测的TOC仪器氧化并准确检测。

结论

        Sievers  TOC分析仪回收标准溶液中这些化合物的能力非常好。牛血清白蛋白（BSA）、头孢他啶（CP） 、葡聚糖硫酸酯（DS ） 、牛血红蛋白（Heme）和人胰岛素（HI），以平均95％被回收。本研究为清洁验证的非专属但高度灵敏的TOC分析方法提供支持，特别是本案例中的UV/过硫酸盐方法。此应用具有巨大的价值，因为与其他方法相比，该技术具有低水平的检测限（ppb）、分析时间快并且操作成本低。

讨论

       国际医药科技协会（PDA）列出了用于验证和监控清洁的许多合适的物理、化学和生物技术，其中包括针对特殊分子的试验以及许多非特定试验。在查看性能比较和参考之后，PDA特别提到，“典型的清洁验证研究可使用pH、电导率、总有机碳、洗涤剂试验，若有多产品设备，则使用产品专用的试验。”应比较分析的精度、准确度、检测限、定量限、选择性、线性、范围和灵敏度。进行了许多科学研究以评测性能，比如符合的通用方法：高性能液相色谱（HPLC）、薄层色谱（TLC）、UV光谱、总有机碳（ TOC ） 、酶联免疫吸附剂测定（ELISA）、胶体电泳和电导率等常用方法。药物残留、赋形剂、清洗剂残留和反应副产物都显示了该方法的优点和缺点。

       仔细选择清洁验证（CV）分析的仪器应是任何清洁验证主计划实施的一部分。TOC的使用，应该是仅有的几种类型 之一，以其氧化方式不同为特点。可使用燃烧炉、加热的过硫酸盐溶液或者紫外灯存在下的过硫酸盐溶液进行氧化。Sievers Model 使用UV/过硫酸盐氧化方法，并使用其ZL膜电导测量技术测定清洁验证样品的TOC浓度。

       本研究检验牛血清白蛋白（BSA）、头孢他啶（CP） 、葡聚糖硫酸酯（DS ） 、牛血红蛋白（Heme）和人胰岛素（HI）在多种浓度下的回收率。表1所示为回收数据一览表。

表1.牛血红蛋白(Heme)、牛血清白蛋白( BSA)、头孢他啶（CP）、葡聚糖硫酸酯(DS) 和人胰岛素(HI)

       所研究化合物的平均回收率为95.9％，范围在73％至129％之间。化合物回收率很好且在预料之中，然而葡聚糖硫酸酯的回收率范围在118％至131％之间。 在此研究时，还不清楚这么高回收率的引起原因，但对化合物进行进一步查看，以便找到可能的解释。值得注意的是，葡聚糖硫酸酯以及其他的所有化合物的回收率线性在浓度范围内非常好。这使得可通过应用相关的曲线方程方便地预测未知浓度的样品。图1是包含各化合物线性的图，而各公式在表2中。所研究各化合物的线性非常好。

图1：BSA、CP、DS、Heme和HI的线性总结

表2 BSA、CP、DS、Heme和HI的线性总结

小结

       当进行回收这组生物医药行业常用的大分子时，Sievers TOC分析仪进行得很好。表明UV/过硫酸盐法可用于将化合物中所含的碳氧化为CO2，进行量化。 许多医药相关的设备已经成为非特定但高灵敏度TOC分析仪用于清洁验证的很好案例，请注意与其他方法相比，该技术检测含量低（ppb）、分析时间快并且成本低，而且可检测众多碳基残留。

材料和技术

试剂

1. 6M的磷酸溶液

在含有1L低TOC水的5L容量瓶中加入2 L 85％的磷酸，并用低TOC水稀释到体积刻度。

2. 15％过硫酸铵溶液

在5L低TOC水中溶解750 g过硫酸铵。

3. 低TOC水。

材料

1. 牛血清白蛋白（BSA）：Fluka已测定@54.45%碳。

2. 人胰岛素（HI）：Fluka已测定@44.1%碳。

3. 头孢他啶（CP）：SmithKline Beecham已测定@41.5%碳。

4. 葡聚糖硫酸酯（DS）：Aldrich已测定@18.56 %碳。

5. 牛血红蛋白（Heme）：Aldrich已测定@49.87 %碳。

6. 容量瓶和移液管（使用稀释的Steris CIP 100™溶液清洗并使用20 次低TOC 水漂洗）。

仪器

1．Sievers 总有机碳分析仪

2．Sievers TOC 自动进样器

参考资料

✦1. Agalloco J. “Points to consider in the Validation of Equipment Cleaning Procedures,”（设备清洁步骤验证中的注意点），J. Parenteral Sci. Tech., 46 (5): 163-168, (1992) Cooper D. W., Cleaning Aseptic Fill Areas,. Pharm. Technol. 20(2): 52-60 (1996)

✦2. Dolch G., Baffi R., Garnick R., Huang Y. F., Mar B., Matsuhiro D., Niepelt B., Parra C., Stephan M., “A Total Organic Carbon Analysis Method for Validating Cleaning Between Products in Biopharmaceutical Manufacturing,”（用于生物医药生产中清洁验证的总有机分析方法），J. Parenteral Sci. Tech.,45 (1): 13-19, (1991)

✦3. FDA Guide to Inspections of Validation of Cleaning Processes（清洁验证步骤检查的FDA指南），July 1993, p. 8.

✦4. Godec R., Kosenka P., Hutte R., “Method and Apparatus for the Determination of Dissolved Carbon in Water,”（水中溶解碳测定的方法和器械），U.S. Patent No. 5,132,094 (July 21, 1992)

✦5. Harder S. W., “The Validation of Cleaning Procedures,”（清洁步骤的验证），Pharm. Technol., 8 (5), 29-34 (1984)

✦6. Jenkins K. M., and Vanderweilen A. J., “Cleaning Validation: An Overall Perspective,”（清洁验证：全面观察），Pharm. Technol., 18 (4), 60-74, (1994).

✦7. Parenteral Drug Association, Cleaning and Cleaning Validation: A Biotechnology Perspective（非肠道药物协会，清洁和清洁验证：生物技术展望），PDA, Bethesda, MD, 1996

✦8. Smith J. M., “Selecting Analytical Methods to Detect Residue from Cleaning Compounds in Validated Process Systems,”（选择分析方法以检测来自验证的工艺系统中清洗化合物的残留），Pharm. Technol., 17 (6), 88-98 (1993)