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实时荧光定量PCR技术是通过测定RNA的转录水平来评估基因的活力。RNA样本提取的质量直接影响基因表达分析。影响RNA品质的因素有以下三种：RNA浓度、RNA纯度和RNA完整性。

检测RNA浓度、纯度和完整性的方式主要有以下几种：

紫外分光光度计法：

测量260nm吸收值计算RNA浓度，测量260nm/280nm吸收值的比值，用于评估RNA纯度。需要注意的是：在检测核酸物质时应该在固定的PH溶液中进行。

260nm/280nm的比值范围在 1.9~2.1 之间。＜1.9，说明有蛋白质残留；＞2.1，说明RNA可能发生降解。

琼脂糖凝胶电泳：

完整的RNA通常有三条带，最亮的是28S条带，其次是18S条带，最淡的是5S条带（部分试剂盒提取时会过滤掉5S条带）。通过琼脂糖凝胶电泳可以检测28S和18S的比值。该方法主要用于检测RNA的纯度和完整性。

如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利，28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量好。

若RNA条带出现弥散，原因可能：RNA被核酸酶降解、电压或电流过大、上样量过高或过低等。

上述两种方法在实验室比较常用，此外还有几种检测方式供大家选择。

荧光染料检测：

通过荧光染料和RNA结合，荧光活性增强。此方法的灵敏度较高，主要用于检测RNA的浓度。

微毛细管电泳：

可使用软件的RIN（RNA Integrity Number）分数评估，10为RNA完整性好，0为最差。此方法的灵敏度和分辨率较高，可用于检测RNA浓度、纯度和完整性。

3’-5’完整性检测：

是在一个RNA样本中检测GAPDH mRNA的完整性来代表所有RNA的完整性，主要用于检测RNA的完整性。

得到高品质RNA的小建议：

1、尽量避免RNA酶污染，使用无RNA酶的耗材和试剂，建议将扩增前后的场所分开。

2、尽量减少采样时间，样品处理后快速冷冻，可以加入RNA保护剂。

3、RNA提取过程中可以使用RNA酶YZ剂。

4、存储过程中避免反复冻融。

Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统

Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统来自于美国Azure Biosystems公司，可为您提供3/6检测通道，根据实验需求灵活配置。这款产品采用了高能LED作为光源系统，可保证光源强度高，光源一致性好；高品质的帕尔贴温度模块作为温控系统，升降温速率快，可设置12列跨度30°C的温度梯度；ZY的CMOS拍照+光纤信号传输作为检测系统，CMOS检测灵敏度高，光纤传输速度快，无光损失和噪音干扰，无需ROX校准。Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统可为您的科学研究提供高灵敏度和高可靠性的实验结果。

       在这场突然爆发的新冠疫情中，那些每天不断攀升的确诊病例的数字牵动人心。由于缺乏针对COVID-19病毒的特 效药和疫苗，新冠肺炎患者在与病毒搏斗的过程中，自身的免疫能力显得尤为重要。

       日前，国家卫健委发布了《新型冠状病毒感肺炎诊疗方案（第六版）》^[1]，推荐雾化吸入α-干扰素作为抗病毒的一般ZL手段之一，通过刺激人体免疫细胞来增强自身免疫功能。目前在ZG临床试验注册ZX申请登记的199项针对新冠肺炎的临床项目中，多项临床ZL项目均将雾化吸入α-干扰素作为基础用药^[2]。另外，美国Pulmotect公司也宣布，其研发的雾化吸入型免疫刺激剂PUL-042显示了良好的临床前效果，PUL-042能直接刺激和提高肺部免疫系统功能，将来有望成为ZL包括新冠肺炎在内的多种肺炎的吸入药物^[3]。那么与传统的口服、肌肉注射或静脉给药等方式相比，雾化吸入ZL有哪些优势呢？

       雾化吸入疗法是指通过雾化装置将溶液剂或混悬剂分散成直径介于1~5μm的微粒，通过惯性撞击、重力沉降和布朗运动沉积到肺部进行局部ZL或全身ZL，具有起效迅速、全身不良反应少、患者顺应性好等优势，且无肝脏首过代谢、极端pH和酶活等影响。尤其是对呼吸系统和肺部疾病而言，通过雾化吸入直接给药到肺部，因肺泡区具有巨大的比表面积、Z小的物理屏障和丰富的血液供应，非常有利于药物快速吸收，往往使用更低的药物剂量即可迅速达到良好的LX，因此雾化给药一直是呼吸道系统疾病ZL的重要手段。

       对于雾化吸入制剂的质量评价而言，一项关键参数就是药剂经雾化装置分散后递送出的雾滴粒径分布。一般认为粒径0.5~7μm的药物微粒才能到达肺部发挥药效，因此应将雾化后的药物微粒粒径控制在10μm以下，其中大多数应在5μm以下，以确保药物能有效沉积到肺部起效。目前吸入制剂粒径分布测量方法主要有惯性撞击法和激光衍射法^[4], 因激光衍射法具有测量速度快、测试通量高，且实验操作简单方便等优势，是吸入制剂研发和生产过程中进行快速的研究和质量控制的理想方法。

       马尔文帕纳科Spraytec激光衍射喷雾粒度分析仪，测量下限低至100nm, 可实时精确测定吸入制剂的粒径分布，开放式光学平台同时适用于鼻喷雾剂、干粉吸入剂、气雾剂和雾化吸入剂，也可用于鼻喷泵、雾化器等给药装置的质量评价。

示例：雾化给药测量过程及其结果

       马尔文帕纳科Spraytec激光衍射喷雾粒度分析仪采用激光衍射技术测量吸入制剂和鼻喷剂药物颗粒粒度。当激光束穿过喷雾时，测量雾粒或气溶胶颗粒的散射光强，并通过散射光强度分布计算出通过激光束的药物粒子的粒度分布。

参考资料：

1. 《新型冠状病毒感肺炎诊疗方案（第六版）》

2.  ZG临床试验注册ZX（www.chictr.org.cn）

3. Pulmotect’s PUL-042 Shows Promising Pre-Clinical Efficacy in Preventing Lethal Coronavirus      Infection.  (http://pulmotect.com/news/)

4. 《ZG药典 2015版》通则0951， 吸入制剂微细粒子空气动力学特性测定法

（来源：马尔文帕纳科）

1. 如何对污染进行监测？

RNA质量控制分为三个部分，一是浓度，二是纯度，三是完整性。对于基因表达实验来说，了解物质的起始浓度是很重要的。在比较来自不同样本的结果时，应使用相同的样本量。此外，确定材料的起始浓度也可以对后续的实验步骤进行优化。样本可能会被蛋白质、基因组DNA或其他有机化合物污染。这种污染可能会影响RNA的量化，同时下游应用及其结果的相关性也可能受到这种污染的影响。基因组DNA、DNA结合蛋白、酚类化合物或在RNA提取过程中引入的外源性颗粒（如手套中的粉末），已被证明可以抑制下游逆转录和PCR扩增步骤。与DNA相比，RNA是一种相对不稳定的分子。因此，RNA的完整性是RNA样本整体质量的重要组成部分。为了避免降解，RNA样本必须小心地保存，或者在非常低的温度下沉淀或者冻干。

为了比较基因表达数据，必须使用可靠的标准化方法。MIQE指南强调，所提供的实验数据应包括仪器信息、RNA提取方法以及RNA样本的浓度、纯度和完整性。高质量的RNA应当避免RNA酶的污染，勤换手套，使用无RNA酶的试剂和耗材，使用专门的无RNA酶设备用于提取，设立PCR前和PCR后的实验分区。取样时尽可能缩短取样时间，于液氮中快速冷冻，加入适量的裂解缓冲液和RNA保护剂。在RNA提取时，确保组织在裂解过程中是冷冻状态，并使用RNA酶yizhi剂。提取的RNA在适宜条件下存储，-80℃可长期保存，避免反复冻融。如何明确用于RT-qPCR检测的RNA是否合格？接下来给大家详细介绍一下RNA质控的具体方法。

2. 总RNA质量控制方法

RNA质量控制可以多种方法进行，它们适用性也各不相同。

分光光度计

总RNA可以利用紫外光的强吸附特性使用核酸分光光度计进行定量，但缺陷是这种紫外光谱方法并不能区分不同类型的核酸，因此最常见的污染物如基因组DNA可能会显著影响测定结果。为了更精确的RNA定量，污染的基因组DNA必须被DNA酶消化去除。游离核酸也有助于增加在260nm处的吸收，因此可能需要在DNA酶处理后进一步纯化总RNA。通过测定样品的OD值去评估RNA纯度，OD260/280在1.9-2.1之间的样本纯度较好，当OD值小于1.9，说明有蛋白质残留，OD值大于2.1说明RNA可能发生降解。该方法适用于测定总RNA的浓度和纯度；然而，这种方法不能提供任何关于RNA完整性相关的信息。

荧光染料测定

另一种评估RNA浓度的高灵敏度方法是测量与RNA结合并在结合时发出选择性荧光染料的荧光强度，例如RiboGreen®。染色后的样品可以用荧光计在试管或微孔板上进行定量。基因组DNA残留会影响测定结果，因此为了更准确的RNA定量，用DNA酶处理是必要的。此外，基于荧光染料的总RNA定量只测量聚合的核酸，而不会检测到受污染的蛋白质和游离的核糖核苷酸。这种敏感的方法对RNA丰度非常低的样本非常有用。MIQE的RNA定量指南推荐采用基于荧光的检测方法。然而，它只适用于总RNA的定量，并不能提供关于RNA的纯度和完整性的相关信息。

3'：5'完整性分析

以GAPDH作为目标序列的 3'：5'检测已被提出作为mRNA完整性的替代测量方法。在GAPDH mRNA序列的三个单独的qPCR检测中，GAPDH mRNA序列的5'端、中间和3'端区域均有目标扩增子。所描述的三重检测使用TaqMan®化学方法进行，每个扩增子均由靶标特异性差异标记的探针检测。3'：5'比率描述了3'端和5'端的信号强度的比较。这个值反映了mRNA模板的完整性。3'：5'的比值约为1表示mRNA完整性高，而值大于5表示mRNA降解。所获得的数据独立于核糖体RNA的完整性，并提供了mRNA降解的可量化测量方法。这种分析方法特别适用于在RNA很少时珍贵样本的分析。

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳被广泛应用于核酸片段的定性分析。它是一种基于凝胶的技术，提供基于大小和电荷的核酸分子分离范围。在RNA电泳过程中，带负电荷的RNA通过凝胶向阳极迁移。简单地说，一个RNA分子的长度决定了它的迁移时间。然而，通过分子内碱基配对形成RNA的二级结构可能会延迟迁移，因此，建议在变性条件下进行RNA电泳。在琼脂糖凝胶上分离的总RNA显示出特有的物种特异性条带模式。通常，在真核生物中，可以检测到包含28S和18S核糖体RNA（rRNA）的两条主要条带。当28S:18S rRNA比值为2或更高时，我们认为总RNA是高质量的。琼脂糖凝胶电泳相对便宜，容易获得，然而，由于缺乏标准化和客观性，MIQE指南不推荐使用琼脂糖凝胶电泳。此外，琼脂糖凝胶电泳需要大量宝贵的RNA样本，涉及危险化学品的处理，并不提供RNA定量的相关信息。

毛细管电泳

毛细管电泳可用于分离和量化RNA样本。与经典的凝胶电泳相比，这种电泳模式显著减少了不同类型核酸的分离时间以及试剂和样品的消耗。毛细管电泳可以提供RNA完整性和浓度的分析。RT-qPCR的性能受RNA完整性的影响，而PCR的效率一般不受影响。测定后RIN值大于5的总RNA被认为是质量良好，RIN值大于8的被认为是完整的总RNA。不同生物体和特定样本类型有特定RIN值要求和阈值水平。作为一种方便和客观的评估RNA数量和完整性的方法，该方法与MIQE指南理念完全一致，因此经常被推荐用于总RNA质量控制。

3. miRNA质量控制方法

RNA质量的测定也应用于其他方面，如microRNA（miRNA）表达谱分析。传统的分光光度法不适用于测定这些短的、非编码的RNA分子的浓度。RNA提取方法对于保留miRNA和小RNA组分是至关重要的。由于miRNA和小RNA的迁移类似于降解的总RNA，高浓度的这些物种类型可能因此产生低于预期的RIN值。RIN阈值的确定可能需要根据特定的提取方法进行调整。

4. 总结

在开展RT-qPCR和转录组测序等这种通过测定RNA转录水平来评估基因表达的实验时，我们需要对样本的总RNA质量进行严格把控。通过多种方法的结合，检测出可用于下游实验的RNA，样本质量质控通过后，后续的基因表达分析才是有意义的。