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液滴生成油Surf2-DG7500是经过改进后的含PFPE-PEG混合结构的表面活性剂，用于微液滴小球产生的连续油相，呈现电中性，用于稳定分散相和连续相之间的界面，避免液滴内物质的泄露和液滴之间的团聚或堆叠。

液滴生成油Surf2-DG7500是一种液体状态，即开即用，广泛应用于酶反应、3D细胞培养、单细胞包封、单细胞测序、蛋白质结晶、水凝胶合成、DNA合成及液滴微流控与液滴分选等领域。

主要优势如下：

• 油相为氟油7500，具有生物相容性，对细胞没有毒害作用；

• 表面活性剂是PFPE-PEG的混合物

• 可产生10 - 300μm粒径的微液滴

• 具有良好的热稳定性，液滴经高温处理后，没有明显的融合；

• 即开即用

• 提供2%和5%两种浓度

• 后续可继续用氟油7500进行稀释

• 提供10mL和50mL包装

FluoSurf (2%, w/w) in HFE 7500 含氟表面活性剂 

Zhu B, Du Z, Dai Y, Kitguchi T, Behrens S, Seelig B. Nanodroplet-based reagent delivery into water-in-fluorinated-oil droplets. ChemRxiv. Cambridge: Cambridge Open Engage; 2023;  

体外区隔化是一种生成油包水微滴的技术，用于建立基因型(DNA信息)-表型(生物分子功能)连锁，这是许多生物学应用所需要的。近年来，由于氟化油具有较好的生物相容性，在微滴制造中得到了越来越广泛的应用。然而，需要在含氟水的油微滴中添加试剂来进行多步反应是困难的。芯片上的微滴操作通常用于此目的，但它可能遇到一些技术问题，即低通量或将试剂递送到不同的微滴中有时间延迟。因此，我们评估了采用基于纳米液滴的方法使用铜离子和中等大小的肽(2 kDa)分子来解决这些问题的可行性。

数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变。

微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR, DDPCR）是第三代 PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术，是一种对核酸分子进行绝对定量的方法。

DDPCR的原理是在PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

在ddPCR中的微液滴产生中，ddPCR-DG7500油相可以直接和PCR扩增试剂（包含待测的DNA样品）注入到液滴合成芯片中，产生所需要尺寸的乳液滴微球。随后，将获得的乳液滴微球进行PCR扩增。

ddPCR-DG7500油相是一种包含PFPE-PEG混合结构的HFE7500油相溶液，可以直接用于ddPCR中的乳液微球产生，无需再进行二次处理。该油相可以帮助用户节省实验时间，获得良好的实验结果，同时把精力用于目标产物上，不用担心因油相质量不稳定而产生的不良目标产物。

ddPCR-DG7500油相试剂是一种液体状态，提供1mL包装和2mL包装的两种规格。

名称：数字PCR油相7500试剂

型号：ddPCR-DG7500

规格：液体状态，4℃环境保存，体积：1mL，EP管包装，即开即用。

微流控液滴技术是近年来在微流控芯片上发展起来的一种研究几微米至几百微米尺度范围内微液滴的生成、操控及应用的新技术。微液滴常作为微反应器，实现生化反应、试剂快速混合以及微颗粒合成等，极大地强化了微流控芯片的低消耗、自动化和高通量等优点。本次网络课堂主要介绍了微流控液滴的动态分析部分如速度场、表面活性剂等知识。

微流控微液滴系统是微流控芯片领域的一个分支，其采用两种不相溶的流体在微孔道的界面处形成微液滴，微液滴的体积通常在nL - pL范围。微液滴由于具有体积小、无交叉污染、反应快速、装置简单、重复性好、易于精确控制等优点而得到了快速发展，其广泛应用于生物、化学、医学、材料等领域。

液滴微流控系统中两相流流体流动的长时间稳定性、快速响应性及操作的便携性对于微流控微液滴制备来说是必须要考量的一个事项。将两相互不相容的流体稳定而又快速的推进微流控芯片的通道内时需要使用微流控驱动泵比如哈佛注射泵（Harvard pump）、蠕动泵、压力泵（Elveflow OB1 MK3压力泵，Fluigent FlowEZ或MFCS-EZ压力泵）等。当制备的微液滴尺寸小于20μm时，压力驱动泵因其以气体压力驱动的快速性而比注射泵有很明显的优势。除了压力泵响应的快速性外，压力驱动泵还具有很高的压力分辨率、集成度高、操作简便等优势。

对于比较常见的两相流流体制备微流控微液滴来讲，我在此介绍一套微液滴发生器套装—Elveflow Droplet Generation Pack，该套装可满足大部分微液滴制备的需求。下面用该套装制备油包水液滴。

实验装置

该套装产生的油包水液滴的如下图所示。

Elveflow微流控OB1压力控制器/压力泵结合流量传感器制备快速、稳定的油包水液滴视频如下：

微流控液滴的应用
1、高分子合成
2、细胞培养
3、PCR
4、双重微乳液
5、水凝胶合成
6、RNA序列
7、单细胞分析
8、药物输运

该微流控液滴套装主要包含如下3件东西：
1、压力泵控制器/压力泵 OB1 MK3（2 channels - 2 bars）   

2、PDMS微流控芯片

3、2个流量传感器

此外，还包括如下的其他东西：
1、油和表面活性剂 - 20 mL （HFE 7500 +2%活性剂）
2、15 mL储液池，包含储液池的盖帽
3、外径OD 1/32”导管
4、1/4” - 28的适配器
5、Luer locks适配器
6、1/16” OD外径的FEP微流控套管
7、压力源快速连接套装
8、气动聚氨酯（PU）柔性管
9、ESI Elveflow软件

Elveflow OB1微流控压力控制器/压力泵因其出色的性能而被用于如下微液滴制备的论文中
1、D. Weitz et al., Macromolecular Journal, High-Throughput Step Emulsification for the Production of Functional Materials Using a Glass Microfluidic Device
2、A. J. deMello et al., Lab on a Chip, Nov 2015, Controllable generation and encapsulation of alginate fibers using droplet-based microfluidics
3、G. Whyte et al., Scientific Reports, Sept 2017, Image-based closed-loop feedback for highly mono-dispersed microdroplet production
4、Say Hwa Tan et al., Analytical Chemistry, Feb 2017, Negative Pressure Induced Droplet Generationin a Microfluidic Flow-focusing Device
上述OB1 MK3制备油包水微流控液滴的详细介绍也可以参见Elveflow公司的如下链接：

Droplet pack - Easy Generation

更加详细的内容介绍，请查看如下链接：http://blog.sina.com.cn/fangdzxx

也可以随时关注我们的微信公众号：信号测量与微流控系统

细胞是生物结构和功能的基本单元，在类型和状态上有很大差异。在大多数生物系统中，我们对细胞多样性的认识是不完整的，就像神经系统（脑细胞）这样的复杂组织[1]。单细胞识别和功能的表征，作为对每个细胞的功能和反应的理解，将加速生物领域的发现。它可能是癌症、肿瘤，几何任何可能在细胞群中具有多样性的东西。然而，今天的技术并不能提供一种简单的方法来同时分析大量的单个细胞。快速、可扩展的液滴测序（Drop-Seq）这种方法可以用来表征具有许多细胞类型和状态的复杂组织。

Drop-Seq的原理和好处
Drop-Seq是一种基于使用微流体技术的方法，通过将它们封装在微小液滴中进行平行分析，可以快速分析数千个单个细胞。

这些纳升级水性隔离室已用于微流体器件中的许多应用：纳米颗粒制造、乳液和泡沫、药物输送，但也作为PCR和逆转录的微小反应室[3]。Drop-Seq使用液滴将细胞分隔成纳升大小的反应室，用于分析其mRNA转录物，同时使用分子条形码策略记住转录物的起源细胞。通过这种技术，一个科学家每天可以制作10000个单细胞库，实验并行进行且简单。因此，该方法将允许为已知细胞类别和新的候选细胞亚型产生基因表达的分子图谱。

Drop-Seq利用微流体的优势

（1）很短的时间内有很高的吞吐量

（2）尽量减少昂贵样品的消耗

Drop-Seq包含以下步骤

1. 从组织中制备单细胞悬浮液
2. 准备条形码引物（或者在微颗粒表面或者在内部）
3. 使用微流体装置将每个细胞单独地与一个微小条纹的微粒共同包覆或封装在一个微小的液滴中
4. 一旦分离成液滴，裂解细胞，释放它们的mRNA，然后与引物（primers）杂交。
5. 打破液滴并产生STAMP（附着于微粒的单细胞转录组）
6. 放大STAMP
7. 测试和分析：使用STAMP条形码推断每个转录物的起源细胞

Drop-Seq可以使用2种beads：
A：“简单”的微粒
B：水凝胶微粒

该项工作的ZD是“简单”微粒的使用，并简要介绍了水凝胶微粒，其原理保持不变。

Drop-Seq使用简单的微粒
1. 从复杂的组织中准备单细胞悬浮液
将复杂组织解离成单个细胞

2. 引物（primer）合成
微粒上的引物序列
每个微粒包含超过108个单独的引物，它们共享相同的“PCR句柄（PCR handle）”和“细胞条形码（cell barcode）”，但具有不同的独特分子标识符（UMI）。事实上，PCR句柄在所有引物和beads上具有相同的恒定的序列，这允许在STAMP形成后进行PCR扩增。细胞条形码，仅在相同微粒的所有引物上相同但与其他beads上的细胞条形码不同，允许回复细胞的起源。每种引物上不同的UMI允许对mRNA转录物进行数字计数并鉴定PCR duplicates。Z后，在所有引物序列的末端存在30bp的oligodT序列，用于捕获mRNA并引发逆转录。

细胞条形码的分裂和池合成（split-and-pool synthesis）
为了产生细胞条形码，将微粒库重复分成四个大小相等的寡核苷酸合成反应，向其中加入四个DNA碱基中的一个。然后，在每个循环后将微粒合并在一起，并进行总共12次分裂-池循环（split-pool cycles）。结果是一个微粒库，每个微粒具有4^12（16,777,216）个可能的DNA碱基序列之一。[4]

合成独特的分子标识符（UMI）
UMI的合成在“分裂-池（split-and-pool）”合成循环完成后进行。将所有微粒一起进行八轮简并合成，每个循环期间可获得所有四种DNA碱基，使得每个单独的引物接受4^8（65,536）种可能序列（UMI）中的一种。[5]

3. 微流体装置
一旦单细胞悬浮液和微粒准备就绪，使用定制设计的微流体装置将单个细胞与微粒一起包覆在液滴中。

Image courtesy of Patrick Stumpf, Matthew Rose-Zerilli, Rosanna Smith, Martin Fischlechner & Jonathan West at the Centre for Hybrid Biodevices & Cancer Sciences Unit at the University of Southampton

该装置在它们分成离散的液滴之前连接两路水相。层流防止在液滴形成之前混合两种水相输入，一路流相包含细胞，另一路流相包含悬浮在裂解缓冲液中的条形码引物beads。

微流体装置
组件列表
（1）倒置显微镜
（2）压力控制器+3流量传感器/三个注射泵
（3）3个falcon管/3mL注射器
（4）磁力搅拌系统
（5）用于实验装置元件连接的微流体导管
（6）微流体配件和连接器
（7）PDMS共流微流体液滴生成装置
（8）用于beads的100微米细胞过滤器
（9）用于细胞的40微米细胞过滤器
（10）计数室

实验装置连接示意图

4. 细胞裂解和RNA杂交
在液滴形成后，立即将每个细胞在液滴内裂解并释放其mRNA。然后，它们与其伴随的微粒表面上的引物杂交。

5. STAMPS产生
为了一次有效地产生数千个STAMP，通过添加试剂来破坏液滴以使油-水界面不稳定，并收集和洗涤微粒。然后将mRNA在一个反应中一起逆转录成cDNA，形成一组称为“附着于微粒的单细胞转录组（STAMPs）”的beads[6]。

6. STAMPS的放大
然后可以通过PCR反应在池（pools）中扩增条形码化的STAMP，用于高通量mRNA测序，以分析任何所需数量的单个细胞。

7. 测序和分析
使用高容量平行测序对每个末端对得到的分子进行测序。首先，将读数与参考基因组比对以鉴定cDNA的起源基因。接下来，通过细胞条形码组织读数，并且对每个细胞中确定的每个基因的mRNA转录物的数量进行数字计数。这是UMI发挥作用的地方，避免从同一mRNA转录物中重复计数序列读数。随后，可以建立数字基因表达测量矩阵（每个细胞每个基因一个测量）用于进一步的分析。

使用水凝胶微球的Drop-Seq测序
关于水凝胶beads的使用，操作原理或多或少与以上保持相同，即Z大的区别在于引物（primers），它们位于微粒内而不是位于它们的表面上。

为此，微流体装置由三个通道而不是两个通道组成：
（1）带beads的一个通道（Z关键的部分）
（2）把细胞带入液滴的一个通道
（3）带来我们需要进行分析的化学试剂的一个通道

至于“简单微粒（simple microparticles）”的使用，水凝胶beads含有可用于逆转录反应的引物，然后随后对液滴内的细胞内容物进行条形码编码，由此获得作为RNA序列的拷贝的DNA序列的集合，并且现在通过它们来自哪一个液滴来对这些序列进行分类。

然后，可以打破液滴并将整个细胞群作为大量样品处理，知道每个细胞已被单独编码。

相关的资源
开源链接：McCarroll Lab

液滴测序：Droplet-Sequencing

参考论文
[1] L. Luo et al., Genetic Dissection of Neural Circuits.
[2] B. J. Hindson et al., High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.
[3] N. R. Beer et al., On-Chip Single-Copy Real-Time Reverse-Transcription PCR in Isolated Picoliter Droplets.
[4-6] Macosko et al., Highly Parallel Genome-Wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.

倒置显微镜MI52-N下的液滴小球|微流控应用

倒置显微镜 MI52-N 是一款高品质的光学显微镜，可用于生物、医学、教学等领域。其特殊的倒置设计使得观察细胞样品更加方便，同时其无限远光学系统和紧凑稳定的高刚性主体，保证了显微镜的可升级性和稳定性。在液滴小球微流控应用中，倒置显微镜 MI52-N 可以搭配高速相机MS16-H实现对液滴的实时控制和观测。

液滴小球微流控技术是一种先进的实验室技术，该技术利用微流控芯片和液滴操控技术，可以用极少耗材实现样品的处理和控制。例如，可以使用倒置显微镜 MI52-N 相衬观察技术观测液滴的形态和结构，也可以用升级荧光观察的MF52-N对液滴进行荧光观测，检测样品中是否存在特定的蛋白质或分子。

同时，倒置显微镜 MI52-N 搭配高速相机还可以用于液滴的实时控制和观测。例如，可以使用液滴微流控技术制备特定的液滴，并通过倒置显微镜 MI52-N 对其进行实时观测，研究液滴的运动和相互作用。

总之，倒置显微镜 MI52-N 是一种非常重要的实验室工具，可以用于液滴小球微流控应用中的样品预处理和后处理，以及液滴的实时控制和观测。通过使用倒置显微镜 MI52-N可以进行液滴小球微流控研究，推动实验室技术的发展和创新。

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