ACE Excel UHPLC色谱柱与所有市售UPLC和UHPLC仪器兼容

Thermo Scientic Accela

Dionex UltiMate 3000

Waters

• Acquity UPLC

• Acquity UPLC H–Class

• Acquity UPLC I–Class

安捷伦科技

• 1290 Infinity

• 1220 Infinity

• 1260 Infinity
  

• 1200 Infinity

岛津

• Nexera

• Prominence

加上许多其他品牌的UHPLC仪器，恕不能一一列举

ACE® Excel™ 色谱柱

ACE Excel 2μm UHPLC色谱柱

• 与所有市售UPLC和UHPLC仪器完全兼容

• 为UHPLC色谱柱提供口碑zhuo越的ACE HPLC色谱柱优势

• 为UPLC/UHPLC使用者提供了更多选择的固定相，包括强大的C18-AR和C18-PFP相

• 提供高水平的可靠性和耐用性

• 提供从UHPLC到HPLC再至制备型LC的易扩展性

• 适用于UHPLC的2、3和5μm粒径

制造UHPLC色谱柱是比较困难的，且通常认为它们不像HPLC色谱柱那样耐用和可靠。

凭借其在制造Z优质HPLC色谱柱方面的丰富经验，Advanced Chromatography Technologies能够生产出非常可靠的UHPLC色谱柱。

现在，色谱分析师将从UPLC和UHPLC仪器中获得更多的成果。UPLC和UHPLC使用者利用ACE ExcelUHPLC色谱柱现可以获得碱性化合物的峰形、改善柱间的可重现性、获得利用多种分离机制的附加固定相以及改善色谱柱的耐用性。

ACE Excel提供zhuo越的分离度和峰形

条件
流动相A = 5mM甲酸（溶于水中）和B = 5mM甲酸（溶液甲醇中）梯度5分钟内3-100％B
流速：0.6 ml/min
温度：40 ℃
检测：UV, 254 nm
色谱柱尺寸：50 x 2.1mm

Analytes
1. 对乙酰氨基酚
2. 氢氯噻嗪
3. 甲基苯基亚砜
4. 甲基苯基砜
5. 阿司匹林

6. 非那西丁
7. 1,3-二硝基苯
8. 1,2,4-三甲氧基苯
9. 苯甲酸乙酯
10. 尼美舒利

11. 布洛芬
12. 吲哚美辛
13. 甲芬那酸

这些比较性色谱图显示，C18键合相不能将所有13种分析物完全分离。由于其额外的分离机制，ACE Excel C18-PFP能够基线分离所有分析物。

备注：比较性分离物不代表所有应用。

ACE®是Advanced Chromatography Technologies Limited的注册商标。
ACE ExcelTM和HSCTM是Advanced Chromatography Technologies Limited的商标。
Advanced Chromatography Technologies Limited承认Advanced Scientific Instruments、Agilent Technologies Inc.、Alltech AssociatesInc.、GL Sciences Inc.、Idex Health＆Science LLC、Phenomenex Inc.、Shimadzu Corporation、Thermo Fisher Scientific和Waters Corporation的注册和未注册商标，且与上述这些公司没有任何隶属关系。

ACE Excel UHPLC色谱柱与所有市售UPLC和UHPLC仪器兼容

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• Acquity UPLC H–Class

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ACE HILIC色谱柱检测器兼容性

HILIC是一种能很好兼容众多主流检测器的技术。因此，检测的（检测器的）选择受检测器可用性、所需的检测限制和分析物的理化特性（即：具有发色团或电荷）等综合因素的影响。

UV-Vis检测器

UV-Vis检测器是分析试验室中Z常见的检测器之一。

根据仪器的不同，一次可记录多个波长，以优化分析物覆盖范围。

有时，混合物中的分析物可通过参考紫外光谱库来快速识别。

图10中的例子示出了五种β受体阻滞剂的分离，这些阻滞剂可通过他们不同的图谱清楚识别（识别清楚）。

图10
五种β受体阻滞剂的色谱图和紫外光谱
色谱柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流动相：10 mM甲酸铵pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：UV, 214 nm
样本：
1) 普萘洛尔
2) 醋丁洛尔
3) 索他洛尔
4) 沙丁胺醇
5) 阿替洛尔

折射率检测器

示差折光测器（RID）测量当通过检测器时分析物峰相对参考溶剂（即流动相）的折射率。如果这二者之间存在差别，色谱图中可观察到峰。

RID对缺乏活性发色团的分析物很有用，尤其常用于糖分分析。
RID存在几个方面的劣势。这些劣势包括灵敏度受限和没有峰相关的信息（峰的身份通常需要单独的标准来验证）。

此外，RID只能用于等度条件，因为洗脱剂（洗脱剂组成变化）会改变折射率响应。

作为物理测量，折射率也很受温度的影响，也就是说，基线噪声和再现（重现）性会发生变化。

蒸发光散射检测器

蒸发光散射检测器（ELSD）通过如下方式工作：从LC上喷射输出洗脱液与惰性气体（通常为氮气），以形成液滴在加热室内去溶剂化。

去溶剂化后的分析物被分散的光源击中，然后进行检测（喷射出惰性气体来雾化从LC中输出的洗脱液，形成液滴后在加热管中蒸发，去溶剂的分析物被分散的光源击中然后进行检测）。

探测器（ELSD）需要挥发性洗脱剂，以使HILIC非常适合（HILIC方法就非常适合这款检测器）。ELSD是RID有效的替代选择，因为它非常适合非（无）发色团分析物，灵敏度更高，并且适用于梯度色谱法。

但是，ELSD不提供光谱信息，因此在没有标准的情况下，较难识别峰值（峰的识别很困难）。
对于HILIC分离（分析物），ELSD对发色团有限（有限发色团）的极性分析物更有利，例如甲基丙二酸（MMA）和琥珀酸（图11）。

MMA用作维生素B12缺乏症的生物标志，但琥珀酸与MMA等压（元素相同），因此必须彻底解决以防止假阳性结果。

采用ELSD的HILIC法，其MMA量化比紫外线检测法更好。

图11
甲基丙二酸和琥珀酸的色谱图
色谱柱：ACE 5 HILIC-B,
150 x 4.6 mm
流动相：10 mM
甲酸铵pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：ELSD
样本：
1) 琥珀酸
2) MMA

质谱仪

质谱仪（MS）是LC分离中信息Z丰富的检测技术。

LC的洗脱剂流通常使用惰性气体（如氮气）去溶剂化（LC流出的洗脱液在加热管中被惰性气体去溶剂化），并在检测前电离。

可使用不同的质谱分析仪，如：四极质谱仪、飞行时间质谱仪、离子阱质谱仪等。有机物含量较高的HILIC洗脱剂特别适合MS检测。

有多个电离源可用，根据具体应用进行选择。

喷雾电离质谱（ESI）很常用，但也使用电晕放电和光电离源。MS具有高度专一性，因为可利用选择性离子检测（SIM）进行跟踪（因为可以使用选择离子性监测来跟踪单个物质的荷质比（m/z），得到更好的选择性），提高灵敏度。MS还可以在不同质量范围内执行扫描，这对未知的样本（样品）很有帮助。

但是，MS扫描通常灵敏度小得多。（具有更小的灵敏度。）

MS可用于检测发色团较弱或者没有发色团的分析物。

作为一种识别工具，MS对HILIC应用也很有帮助，这种应用中分析物具有相似的紫外光谱特性，但质量不同（在HILIC应用中，当分析物具有相似的紫外光谱特性，但质量不同，MS是很有用的识别工具）。

核酸碱基和核苷就是一个很好的HILIC例子。极性分析物腺嘌呤、腺苷和2’-脱氧腺苷的紫外光谱非常相似（图12）。

图12
腺嘌呤、腺苷和2’-脱氧腺苷的紫外光谱对比
蓝色轨迹：腺嘌呤
红色轨迹：腺苷
绿色轨迹：2’-脱氧腺苷
色谱柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流动相：10 mM甲酸铵，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：UV
进样量：2 μL

MS可利用这些分析物不同的质荷比进行检测和识别峰（图13）。SIM用于提高灵敏度。

图13
利用UV和MS联合检测法分析ACE HILIC-N的腺嘌呤和核苷
（a）下列物质的紫外光色谱图：
1) 2’-脱氧腺苷（m/z 252.4）
2) 腺嘌呤（m/z 136.1）
3) 腺苷（m/z 268.3）
(b) 通过MS SIM确认峰
色谱柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流动相：10 mM甲酸铵，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：UV，254nm和MS

ACE® UltraCore™
具有扩展pH稳定性的超惰性实芯色谱柱

超惰性实芯颗粒

•  2.5μm和5μm超纯实芯（表面多孔）颗粒

• 单分散颗粒分布将高柱效与低压相结合

• 在HPLC仪器上实现UHPLC的柱效和性能

SuperC18™和SuperPhenylHexyl™相

• 两种键合相可以为快速、系统方法开发提供互补选择性

• zhuo越的可重现性和色谱柱寿命

• 超惰性相确保优异的峰形

扩展pH稳定性

• 在低、中和高pH条件下探索选择性变化

• 设计用于与LC/MS兼容的缓冲液

• 推荐pH范围1.5 – 11.0

也称为Fused-Core®、核-壳、SPP或核增强颗粒

通过调节pH来利用选择性
应用# 1801

色谱柱：ACE UltraCore 2.5μm SuperC18, 50 x 2.1mm
样品：1）阿替洛尔2）甲基苯基亚砜3）毒扁豆碱4）丙胺卡因5）布比卡因6）丁卡因7）1,2,3,4-四氢-1-萘酚8）卡维地洛9）硝基苯10）甲地嗪11）阿米替林12）苯戊酮
温度：40°C
流速：0.60Ml/min
波长：254nm
梯度：在5分钟内3 – B
酸性流动相：A：20mM甲酸铵（溶于水中）（pH3.0） B：2mM甲酸铵（pH 3.0）（溶于90:10 v/v 乙腈/水中）
碱性流动相：A：0.1％NH3（= 18mM）（溶于水中）（pH 10.7） B：0.1％NH3（= 18mM），pH 10.7（溶于90:10 v/v 乙腈/水中）

用于改善色谱分析和稳定性的封装键合技术（EBT™）

 ACE UltraCore SuperC18和SuperPhenylHexyl（苯基-已基）相使用我们独特的封装键合技术（EBT™）制造。
该技术显著增加了硅胶表面的配体覆盖率，有效消除了未键合硅醇基团的不利影响。
更高的配体覆盖率可以使惰性、色谱性能和稳定性得到改善。

ACE® UltraCore™固定相几乎消除了硅醇对UHPLC和HPLC分离的不利影响

色谱柱惰性比较

• 来自lingxian制造商的实芯色谱柱

• 对碱性分子吡啶的柱效比较

• 在50％峰高处测量的柱效

市场常见色谱柱峰柱效比较：

色谱柱尺寸：50 x 2.1mm

样品：1）尿嘧啶2）吡啶3）苯酚
流动相：30:70（v/v）甲醇/10mM NH4OAc（溶于水中）（pH 5.8） 流速0.20ml/min

温度：22°C

波长：254nm
比较数据不代表所有应用，转载已经过英国开放大学的许可。

产品的可用性和规格

ACE UltraCore色谱柱被设计用于LC/MS兼容缓冲液。
为进一步延长UHPLC和HPLC色谱柱的使用寿命，推荐使用ACE柱前过滤器
对于高达5000 psi的HPLC色谱柱连接，推荐使用PEEK™手紧接头（p/n ACE-CC10）
对于高达25000 psi的UHPLC色谱柱连接，推荐可重复使用的接头（p/n EXL-CC10）

 ACE UltraCore 2.5μm SuperC18 UHPLC/HPLC色谱柱（具有1000 bar/15000 psi压力限度的UHPLC/HPLC硬件规格）

ACE UltraCore 5μm SuperC18 UHPLC/HPLC色谱柱（具有1000 bar/15000 psi压力限度的UHPLC/HPLC硬件规格）

ACE UltraCore 5μm SuperPhenylHexyl（苯基-已基）UHPLC/HPLC色谱柱（具有1000 bar/15000 psi压力限度的UHPLC/HPLC硬件规格）

ACE®是Advanced Chromatography Technologies Limited的注册商标。ACE®UltraCore™、SuperC18™、SuperPhenylHexyl™和EBT™是Advanced Chromatography Technologies Limited的商标。Advanced Chromatography Technologies Limited承认Advanced Materials Technology Inc.、Phenomenex Inc.、Thermo Fisher Scientific、Victrex Plc和Waters Corporation的注册和未注册商标，且与上述这些公司没有任何隶属关系。  

ACE授权全国总代理,菲罗门全权负责ACE系列产品在ZG大陆市场的销售及售后服务

所有的ACE公司的UHPLC/HPLC固定相都是基于超惰性硅胶的特殊键合与封尾，以此Z小化的二级反应从而获得了优异的峰形
ACE的色谱柱采用了两种柱管:

• ACE的色谱产品有采用HPLC级柱管填装的，这种柱管的Z大耐压是275bar，它适合3um与5um的色谱产品，所有的产品货号是以“ACE-”开头；

• ACE的产品也有采用HPLC/UHPLC兼容柱管填装的，这种柱管的耐压上限是1000bar。它适合于1.7um,2um,3um以及5um等合种粒径的产品，所有的产品是以货号“EXL-”。
  两种柱管的设计都确保了填料的低分散性以及稳定性以获得高柱效

对于同样的3um,5um填料填装于两种柱管时，都给以相同的柱效
例如一支ACE C18 150 x 4.6mm, 5um(货号：ACE-121-1546) 色谱柱相比于一支ACEExcel 150 x 4.6mm, 5um C18(货号：EXL-121-1546U) 色谱柱，将获得同样的选择性与保留行为(对于固定相一样的两种柱管填装柱都有是一样的置换）

ACE C18, 150 x 4.6mm, 5um

每种5支: ACE C18 和ACE Excel C18
所有柱都采用同批次填料
Mean (n=5) Peak 4 Mean (n=5) Peak 4

的重现性基于柱柱间以及两种柱管之间

ACE的1.7um与2um的色谱产品只能采用兼容的UHPLC/HPLC柱管基于背压的需要，所有货号以“EXL-开头”
ACE的UHPLC/HPLC兼容的高压柱管所填装的产品（货号EXL-开头）可以完全取代HPLC柱管填装的同等固定相产品（货号ACE-开头）。不改变分离与保留行为。
同时对于3u的小粒径产品，因为压力原因，“EXL-”置换“ACE-”更有利于获得更长的寿命。

ACE色谱柱的特征

流速可在不损失分辨率的情况下改变2倍。

样品容量指在不损失分辨率的情况下可分析的多肽量。

Z大实际负载指产量和纯度合理的前提下允许纯化的Z多多肽量。

色谱柱ACE

ACE® UHPLC 可重复使用的色谱柱连接器

• 压力额定值> 1700bar（> 25000psi）

• 与所有UHPLC系统兼容

• 与所有UHPLC色谱柱品牌兼容

• 消除连接不良

• 创新且可重复使用的设计

所有UHPLC色谱柱品牌都需要正确安装，以实现Z大柱效。

为了避免出现问题，不推荐使用型压制接头，因为这些接头在安装时不允许在管道、接头与色谱柱入口之间自由移动。

这可能会导致色谱柱连接不良，进而由于向系统引入了额外的柱体积（死体积）表现出非预期的峰拖尾。

或者，可以观察到入口接头连接处有泄漏。
ACE UHPLC色谱柱连接器（p/n EXL-CC）可重复使用，每次均可以使UHPLC色谱柱得到正确安装。

它们独特的设计确保它们可以随着重复使用保持压力等级，但无需性地焊在入口管道上。

为了使接头的使用寿命尽可能Z大，需要使用ACE扭矩扳手（p/n EXL-TW）。
标准ACE HPLC PEEK手指连接器（p/n ACE-FT，压力额定值为350bar / 5000psi）可用在UHPLC色谱柱出口端处，该处压力要求较低，但正确的连接仍然很重要。

市场常见色谱柱惰性比较

• lingxian的3μm、小孔径C18色谱柱品牌

• 50 x 2.1 mm i.d.LC/MS兼容尺寸

• 碱性分子惰性测试

• 峰柱效和不对称性研究

峰柱效比较  

结论
当分析吡啶（一种高碱性小分子）时，可以看到柱效、峰形和选择性的显著差异。
拖尾和保留增加表明，吡啶和固定相上表面的硅醇基之间存在不受欢迎的次级相互作用。

这些相互作用也可能导致色谱柱可重现性不佳。
之前已对ACE C18色谱柱进行了独立测试，发现具有出色的柱效和ji致的惰性。

新型ACE C18-PFP保持了这一优异性能。

ACE®固定相几乎消除了硅醇基对HPLC分离的不利影响

进一步的惰性测试数据包含在ACE HPLC色谱柱目录中。

此外，还提供了C18柱比较指南，其详细介绍了超过50种HPLC色谱柱品牌的材料特性，并将性能与许多测试探针进行了比较。

请联系菲罗门索取资料。

柱体积为LC柱内被洗脱剂占据的体积（即粒子之间的空间和粒子孔内空间）。

柱体积可根据以下公式计算：

Vm=πr2 Lε

其中：

Vm = 柱体积（单位：mL）

 r = 柱半径（单位：cm）
L = 柱长度（单位：cm）

ε = 床层空隙度值

床层空隙度值ε取决于粒子参数（如孔径、表面积等）和供应商。

对于ACE 100 Å多孔柱，ε值为~0.63；

对于ACE 300 Å多孔柱，ε值为~0.75；

而对于ACE 90 Å实芯柱，ε值为~0.55.
在讨论柱平衡时，更准确的是引用达到稳定状态所需的柱体积，因为它与流速和柱尺寸（规格）无关。

例如，表1a示出了一系列ACE 100 Å多孔柱的柱体积值的计算。  

表 1a：ACE 100 Å多孔柱的体积计算值（单位：mL）

表2a显示了各种流速条件下，4个不同尺寸的ACE 100 Å多孔柱达到20和60倍柱体积平衡所需的时间。

表 2a：ACE 100 Å多孔柱平衡计算

ACE HILIC法开发平台和工作实例

图17显示了HILIC方法开发的流程图。
一般方法是：收集分析物相关的信息（如果已知的话），针对三个ACE HILIC相（用三款不同的ACE HILIC色谱柱在不同的pH洗脱液条件下）执行梯度或等度HILIC筛选实验（取决于样本分析物的亲水性范围），然后再优化色谱法以达到可接受的HILIC法。
表1中列出了ACE HILIC筛选条件。

这些设计旨在探索广泛的选择性范围，以及为达到所需分离提供一个良好的起点。

图17
ACE HILIC 方法开发流程图

表1
ACE HILIC筛选实验的条件

ACE HILIC色谱柱保存方法

使用之后，ACE HILIC色谱柱应使用体积比为7:3的乙腈和水进行冲洗，清除掉所有的缓冲盐。

然后，使用的异丙醇、以更低的流速进行冲洗，以便贮存。应往回拧紧色谱柱端盖（拧紧色谱柱端盖），并将色谱柱放回盒内。

每次分析运行之后，除非第二天要使用，否则建议采用密闭法（按长期保存的方法）清洗色谱柱，然后用异丙醇冲洗。

实例1 – 咖啡茵和相关化合物

方法开发中所需的咖啡茵和四种相关化合物（可可碱、茶碱、次黄嘌呤和黄嘌呤）这些化合物都是极性的中性物质，其中负log P值表示合理的亲水性（log P为负值明确的表明其亲水性），因此适用于HILIC（图18）。

图18
咖啡茵和相关物质的结构和log P数据

咖啡茵和相关化合物在pH为3-6的情况下不可电离，因此洗脱剂的pH几乎不会直接影响分子。

为此，选择pH 3.0和4.7。

固定相会受洗脱剂pH变化的影响，这可能是有利的一面。

固定相的电离变化将影响粒子周围的水合层，这会影响分析物分散到相中（分配在固定相上）或形成氢键的程度。

因此，在pH3.0和pH4.7的情况下对三个固定相进行筛选，结果如图19中所示。
新的ACE HILIC色谱柱使用60倍柱体积相互平衡（平衡），以在粒子周围形成水合层。表1中显示了流动相、梯度和温度。
筛选结果显示：三个固定相与两个pH值之间观察到一些选择性差异（三个固定相在两个pH值下的筛选结果可以看出彼此间具有选择性的差异）。

基于筛选数据的Z有效分离是针对pH为3.0下的（pH为3.0下的）ACE HILIC-N相。

这些数据选择（选定这些条件）用于进一步优化。

图19
ACE HILIC色谱柱的梯度筛选

条件如表1中所述，275nm条件下的检测除外。进样25mg/mL的咖啡茵混合物2μL（使用pH3.0和pH4.7的甲酸铵，以0.5%w/w的比例混合相关物质和MeCN/H2O（90:10 v/v））
样本：
1) 咖啡茵

2) 茶碱
3) 可可碱
4) 黄嘌呤
5) 次黄嘌呤

较早洗脱峰的保留窗口（时间段）非常窄，这表示：等度HILIC可用于分离分析物。（等度方式的HILIC可以被用于分离这些化合物）10mM甲酸铵，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）被选为等度条件（图20）。

在这些条件下，峰4和5要保留得更多（好），但峰2和3仍未解析出（被分离）。
根据梯度运行的结果，乙腈含量更高似乎不会提高峰2和3的解析度（高的乙腈含量没有提高2与3峰的分离度），所以梯度HILIC分析得到改善（所以梯度分析是对混合物分离有更合适的，温度将被研究），从而开发出Z终方法，如图21所示。

图20
ACE HILIC-N相中咖啡茵和相关化合物的等度分析

ACE HILIC-N相中咖啡茵和相关化合物的等度分析
色谱柱：ACE 5 HILIC-N，
150 x 4.6 mm
流动相：10 mM甲酸铵，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：UV, 275 nm
进样：2 μL
样本：
1) 咖啡茵

2) 茶碱
3) 可可碱
4) 黄嘌呤
5) 次黄嘌呤

温度的降低会提高茶碱与可可碱之间的解析度（分离度），因此，Z终方法（图21）被认为适合其用途。

图21
Z终开发方法：

色谱柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流动相：A = 10mM甲酸铵（pH3.0）溶于MeCN/H2O中（96:4 v/v）中 B = 10mM甲酸铵（pH3.0）溶于MeCN/H2O（1:1 v/v）中
梯度：0-B在15分钟内，B持续5分钟，下一次进样维持在起始条件20分钟
流速：1.5 mL/min
温度：15 °C
检测：275 nm
进样：2 μL

实例2 – 肌酸和肌酐

肌酸（图22）是使用甘氨酸和精氨酸合成的氨基酸。

它在为体内细胞提供能量方面起着重要作用（在体内主要用于为细胞供能），并形成（生成）副产品肌酐。测定血液中的肌酐，确定肾功能是否正常，其中肌酐水平的增加表示肾可能不会完全过滤废物。（升高表明肾的过滤废物的功能有所降低）

图22
结构和log P肌酸和肌酐数据

图23
使用pH为3.0、4.7和6.0的甲酸铵对ACE HILIC范围的等度筛选对比
样本：
1) 肌酐
2) 肌酸

在三种pH值条件下，利用等度条件对三个HILIC固定相的两种分析物进行筛选。

结果表明：肌酐在三个ACE HILIC相中被适当地保留，但由于过度保留的原因，肌酸在合理的时间内没有洗脱。

根据图17中的流程图，过度保留窗口表示梯度（宽时间段表明梯度方法）可能更适宜。

图24
ACE HILIC-A相下的Z终方法

ACE HILIC-A在pH3.0下选择，进行梯度分析。

标准梯度在10分钟内析出两种目标分析物，并且解析度很高（分离度很高）（数据未显示）。因此，这使得梯度时间进一步减少（这种情况下可以使梯度运行时间进一步减少），从而缩短了整体运行时间。

Z终方法如图24中所示。

色谱柱：150 x 4.6 mm, 5 μm
流动相：
A：2 mM甲酸铵（pH3.0）溶于MeCN/H2O（90:10 v/v）中
B: 2 mM甲酸铵（pH3.0）溶于MeCN/H2O（50:50 v/v）中
梯度：5-55%B，在10分钟内
流速：1.5 mL/min
检测：230 nm
进样：5 μL
样本：
1) 肌酐
2) 肌酸

结论

HILIC是一种用于多用途的极性分析物色谱分析法（对于极性化合物来说是一种通用的色谱分析模式）。

这种方法比较复杂，但如果遵循简单规则，则可实现可再现的HILIC方法（HILIC方法是可以重现性的）。

三个ACE HILIC相（固定相）设计用于HILIC方法开发期间研究选择性，并尽可能快地提供实现所需分离的选项。

ACE HILIC方法验证协议（规程）已成功用于开发一系列的HILIC方法，应为HILIC方法开发活动提供一种结构化的方法。

ACE色谱柱保护柱安装使用说明

ACE独立式保护柱套是专为内径为1.0 - 4.6mm 的 ACE HPLC色谱柱而设计的，与ACE柱耦合器 (C0001)配合使用。

ACE色谱柱保护柱安装使用说明

1. 将保护柱芯放入柱套螺纹较短的那一半内。

保护柱芯是非定向的。

2. 用手将两半的柱套拧紧直至感觉到阻力为止，

然后再用扳手拧紧四分支一圈。

3. 将柱套螺旋纹较短的那一端与手拧柱耦合器  (C0001)一起连接到分析柱上。

这里请用手拧紧，千万不要用扳手。

4. 如果在加压后，两半柱套之间发现有渗漏的情况，请用扳手小心地将两半稍稍拧紧，直到渗漏 停止。

5. 如果在加压后，柱子和保护柱套之间有任何渗漏的情况，请用手小心地拧紧直到渗漏停止。

6. 柱耦合器(C0001)的活动中轴是自适应无实体积匹配各种色谱柱头，切勿抽出遗失。切勿让该配件非均 匀受力，以免折断。

探索ACE C18-PFP的优势：
一种独特的C18键合HPLC色谱柱， 具有五氟苯基（PFP）相的额外选择性

• 将C18和PFP分离机制相结合来分离任一单独相不可能实现分离的混合物

• 改善极性碱性化合物的保留以获得更佳的分离效果

• 超惰性、超高纯度硅胶具有zhuo越的峰形和可重现性

• 为高温应用提供的键合相稳定性

• 超低流失相可以确保UV和LC/MS的兼容性

• 可获得高通量色谱柱尺寸

为什么需要另一种新的C18相色谱柱？
使用超纯、超惰性硅胶具有许多公认的优点，包括改善可重现性、寿命和色谱性能（特别是碱性分子）。

然而，由于超惰性硅胶表面不再有效促进分离，所以用高纯度硅胶制造的C18柱可以显示出接近相同的选择性。

因此，通过改用替代制造商的同等产品，一个lingxian品牌的问题分离很可能不会得到显著改善。

多年来，经验丰富的色谱学家们一直在寻求由这样lingxian的C18色谱柱品牌展示的、具有可靠性能和可重现性优点的相，但另外也为他们的挑战性应用提供了所需的替代选择性。

ACE C18-PFP 色谱柱有何不同？

C18键合相目前主导着HPLC市场，Z近的调查显示，它们仍然占据了所有HPLC色谱柱销售量的50-60％。

近年来，由于其提供的替代选择性，五氟苯基（PFP）键合相的使用显著增长。
然而，与C18键合相相比，PFP相传统上受疏水性降低、稳定性降低和显著柱流失的影响。

ACE C18-PFP相利用一种特别开发的配体，将C18链与完整PFP官能团相结合，形成可以保持lingxianC18相的疏水性、稳定性和低流失特性的相，同时也提供
了PFP相的多重保留机制以实现ACE C18-PFP的独特选择性。

“ACE C18-PFP是一种有价值的方法开发工具 - 是将C18保留性和稳定性与PFP选择性相结合的色谱柱”
lingxian制药公司的研发团队ling导者

何时应用ACE C18-PFP？

由于其相似的疏水特性，ACE C18-PFP色谱柱可用于通常会考虑“标准”C18色谱柱的应用中。

然而，由于其完整的五氟苯基官能团，ACE C18-PFP还被推荐用于涉及卤代芳族化合物、位置异构体和具有不同形状约束的分析物的分离。
应用证实，ACE C18-PFP可用于改善C18色谱柱上存在问题的分离。

独特的ACE C18-PFP相为C18色谱柱提供了替代选择性，但对规定为C18键合色谱柱的方法，保留了有效的选择。

在许多情况下，证实不适合C18色谱柱的相同评估条件被证实适用于C18-PFP色谱柱，这就避免了冗长的方法再开发。

[ACE UltraCore SuperC18色谱柱]人参皂甙分析

Conditions
Column: ACE UltraCore 2.5 SuperC18
Dimensions: 100 x 3.0 mm; 2 x 100 x 3.0 mm (coupled); 3 x 100 x 3.0 mm (coupled)
Part Number: CORE-25A-1003U
Mobile Phase: 

A: 0.1% formic acid in H2O
B: 0.1% formic acid in MeCN

Gradient:

Flow Rate: 0.8 mL/min
Injection: 2 μL (100 x 3.0 mm); 4 μL (200 x 3.0 mm); 6 μL (300 x 3.0 mm)
Temperature: 80 °C
Detection: UV, 203 nm
Sample: 5 x 75 mg tablets ground to fine powder and extracted with 10.0 mL MeCN/H2O (1:1 v/v) for 15 minutes with ultrasonication. 100 μL supernatant diluted with 300 μL water and filtered using a Whatman Mini-Uniprep syringeless filter
System: Chromaster Ultra Rs

ACE毛细管和纳米型色谱柱

• 毛细管（500μm和300μm）和纳米（100μm和75μm）尺寸

• 多种多样的键合相可用，包括ACE C18-AR和ACE C18-PFP

• 100Å和300Å孔径

• 柱效高、寿命长、可重现性好

• 特别适用于LC-MS和LC-MS-MS

除了从分析型（1.0-4.6 mm ID）到制备型（21.2-30 mm ID）广泛范围的色谱柱之外，ACE色谱柱也可提供毛细管（500μm和300μm）和纳米（100μm和75μm）尺寸。

ACE毛细管和纳米型色谱柱提供所有ACE键合相，其孔径为100Å和300Å。使ACE超惰性碱性去活色谱柱成为方法开发化学家选择的相同特征也使其成为毛细管和纳米型HPLC应用的理想选择。

PFP分离机制
ACE C18-PFP相显示有多个保留机制，包括疏水性、π-π相互作用、偶极-偶极、氢键和形状选择性。

虽然下述部分提供了相对强度的近似值，但每个保留机制的优势由溶质的物理/化学性质、其结构和所采用的色谱条件决定。

π-π相互作用

PFP环在相的表面上加入了芳香特性。

然而，PFP相不同于苯基相，因为电负性氟原子会产生缺电子的苯环，使得PFP相可以作为路易斯酸而起作用。

这将与能够给出电子的分析物（即路易斯碱）相互作用。
这与苯基相相反，苯基相含有富电子芳香环（由于不存在吸电子基团），因此它们可以作为路易斯碱而起作用。

偶极-偶极和氢键

PFP环中的碳-氟键具有强极性。

因此，PFP相可以通过在分析物与电负性氟原子之间发生的偶极-偶极或氢键相互作用来额外保留分析物。

任何这样的相互作用将导致保留增加。

形状选择性

PFP具有刚性环结构，当与其它可能的保持机制相结合时，可以赋予PFP相优异的形状选择性。

ACE C18-PFP相显示有PFP相的多重保留机制，色谱科学家们可能会利用这些机制来解决在传统C18相（仅主要依赖于疏水保留机制）上难以分离（即使并非不可能）的混合物。

具有独特选择性的C18 键合相：
1.有保证的可重现性
2.的键合相稳定性
3.疏水和五氟苯基“混合模式”的相互作用

改善色谱分离度
色谱分离的目标是在Z短的时间内获得目标组分的足够分离度（Rs）。

1.5的分离度可以实现基线分离，然而对于可以在实验室之间易于转换的耐用、可重法而言，理想的分离度是1.8-2.0。
分离度方程告诉我们什么变量可以影响分离度：

增加分离度Rs可以通过增加N、α或k来实现。

然而，如图1所示，可以看出，增加N或k以改善Rs的回报率快速下降。

例如，Rs仅随着N平方根的增加而增加。

可以通过增加柱长或降低柱填充材料的粒径或两者的某种组合来增加N。

无论哪种方式，系统背压随着N的增加而增加，因此通过增加N实现令人满意的分离，其“成本”可能是极高的压力。
同样，增加保留值（k值）将会增加Rs，但回报率也快速下降。

将k增加至超过10通常是Rs与分析时间之间的不利权衡，因为只有Rs的边际收益随着保留时间的增加而实现。

该效应的图形表示参见下述图1。

图1 N、α和k对分离度(Rs)的影响
对于典型的分离，其中：N = 10,000, k = 4, α= 1.1

增加N、α或k可以提高分离度(Rs)。

然而，从这些图中可以看出，N或k的提高都会迅速降低回报率。
另一方面，提高选择性（α）则没有这个问题，因此其成为开发分离方法时的Z佳优化变量。

增加α可以增加Rs，但不同于N和k,不会受回报率下降的约束。

α的变化对压力没有影响，对分离时间的影响也是微乎其微的（参见图2）。

因此，在开发分离方法时，α是Z重要的变数。

优化α可以使您在所有目标峰之间达到满意的分离度，同时保持系统背压和分离时间在可接受范围内。

改善色谱分离度- 选择性或柱效？
选择性(α)由流动相、温度和固定相化学物质控制。大多数方法开发策略将探索所有这些色谱变量。
如果使用“标准”3μm C18相没有达到足够的分离度，推荐优化分离的色谱选择性而不是分离柱效，如下述实例所示。
通过简单地将固定相化学物质（即色谱柱）改变为具有替代色谱选择性的固定相化学物质，易于在标准HPLC系统上获得所需分离度，而无需昂贵的UHPLC仪器。

另外，也可以避免复杂的流动相组分、升高的温度和侵蚀性pH条件。

图2利用选择性实现快速、高分离度的分离

样品：1）对乙酰氨基酚2）氢氯噻嗪3）甲基苯基亚砜4）甲基苯基砜5）阿司匹林6）非那西丁7）1,3-二硝基苯
8）1,2,4-三甲氧基苯9）苯甲酸乙酯10）尼美舒利11）布洛芬12）吲哚美辛13）甲芬那酸
色谱柱尺寸：50 x 2.1 mm 流速：0.60 ml/min 温度：40°C 检测：UV, 254 nm 流动相：A = 5 mM甲酸（溶于水中）以及B = 5 mM（溶于甲醇中），梯度= 在5分钟内3- B
比较数据不代表所有应用。

在保持C18键合相的同时，将粒径从3μm减小至2μm以下，并不能显著改善分离效果，另外也会导致压力明显增加。
ACE C18-PFP色谱柱为3个关键对提供了更佳的选择性(α)，因此与2μm以下的C18色谱柱相比，其可以提供的分离效果，即使2μm以下的色谱柱可以提供更高的柱效。
与使用具有高塔板数和高压的色谱柱尝试进行峰分离所获得的结果相比，利用选择性的能力可以获得更佳的分离效果。