植物基因组提取时为什么要65度水浴保温

王者神咩 2017-04-09 16:25:13 997 浏览

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yuan97865 2017-04-10 00:00:00

植物基因组提取时为什么要65度水浴保温因为这个温度Z适合。

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goolring 2017-04-11 00:00:00

植物基因组提取时为什么要65度水浴保温植物DNA提取方法方法一： 1.取两片幼嫩新鲜叶片，置于预冷的研钵中，倒入适量液氮，迅速研磨成粉末状，随后加入3ml预热的2%CTAB抽提缓冲液和50ul抗氧化剂2-巯基乙醇，继续研磨成略有流动性的糊状或粥状，转入1.5ml的离心管中，于65℃水浴锅中保温约60min。 2.待混合物冷却至室温后加入等600ul的CI（氯仿：异戊醇=24：1）溶液混匀，轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液，常温下10000rpm离心10min，取上清液转入另一干净的离心管中。 3.重复步骤（2）一次。 4.取步骤（3）上清液加入2.5倍体积无水乙醇，仔细混匀，-20冰箱30min以上，沉淀DNA 4℃，12000rpm离心10min。 5.弃去上层有机溶剂，加500ul75%乙醇洗涤沉淀，4℃下8000rpm离心5min，弃去上清，洗涤沉淀3次。 6.倒置或者37度培养箱烘干。 7.加50ulTE缓冲液溶解DNA，于-20℃冷藏备用。方法二： 1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ， 60℃水浴预热。 2. 植物5-10g，剪碎，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀， 60℃水浴保温30-60分钟(时间长，DNA产量高)，不时摇动。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀(需带手套，防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟，使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4. 室温下5000rpm离心5分钟。 5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入1倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 6. 在1.5mleppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净吸水纸上吸干，转入含TE的离心管中，DNA很快溶解于TE。 7. 如DNA不形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心5分钟，再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。 8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟，上清液倒入干净的5ml离心管。 9. 加入5μlRNaseA(10μg/μl)， 37℃ 10分钟，除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。 10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀。 11. 用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。 12. 将DNA重溶解于1ml TE， -20贮存。 13. 取2μlDNA样品在0.7% Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍，测定OD260/OD280，检测DNA含量及质量。

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