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一、光纤记录工作原理

人类的大脑拥有约900亿个神经元，神经元之间通过突触相互连接形成了复杂的神经网络，并由此产生各种复杂的功能。大脑能够合成和释放上百种神经递质，神经信号通过突触释放的神经递质从而在神经元之间进行传递（图1）。

图1

当神经兴奋传导到突触末端时，会刺激突触上钙离子通道打开促使钙离子大量内流，胞内钙离子浓度瞬时上升，驱动突触小泡将神经递质释放到突触间隙中，释放出的神经递质随即与突触后膜上的受体结合，将递质信号传递给下一个神经元，从而进行信息的逐级传递（图2）。这些神经元以复杂的通路投射到多个脑区，产生了学习认知、情感、控制、动机、奖励等丰富的功能。光纤记录系统则可以通过检测钙离子和神经递质的荧光变化程度来表征群体神经元的活动情况。

图2

那么光纤记录是如何检测神经活动的呢？

以钙离子荧光信号检测为例，光纤记录系统的技术原理是借助钙离子浓度变化与神经元活动之间的严格对应关系，利用特殊的荧光染料或者蛋白质荧光探针，将神经元中钙离子的浓度通过荧光强度表现出来，并被光纤记录系统捕捉，从而达到检测神经元活动的目的。

在神经系统中，静息状态时神经元胞内钙离子浓度为50-100nM，而在神经元兴奋时胞内钙离子浓度能上升10-100倍，因此我们可以通过注射钙离子基因编码指示剂（Calcium indicator，如GCaMPs、RCaMPs等）来标记钙离子。钙离子指示剂带有荧光蛋白（如GFP、RFP等）及其变异体的蛋白质，可与钙调蛋白（CaM）和肌球蛋白轻链激酶M13域结合（图3左）。当神经活动增强时钙离子通道打开，大量钙离子内流并与CaM结合，导致M13和CaM结构域相互作用，引发cpEGFP结构重排，从而增强绿色荧光信号（图3 右）。

因此我们可以通过检测钙信号的变化来表征神经元的活动，进而研究神经元活动与动物行为的相关性，探究复杂行为背后的调控机制。

图3

(Marisela Morales, et al. Neuron, 2020)

图4：VTA-VGluT2神经元编码先天逃避反应

光纤记录检测神经递质信号的原理与上述方法相同，把cpEGFP嵌入特定的神经递质受体，受体与神经递质结合后会引发受体构象改变并发出荧光信号（图5）。通过病毒注射、转染等技术手段，可以将这种可遗传编码的探针表达在细胞或小鼠脑部，借助成像技术，观察神经递质浓度的实时变化。

图5

(Yulong Li, et al. Cell, 2018)

图6：条件反射实验中伏隔核Nac脑区的DA释放

二、光纤记录实验方法

在光纤记录实验中，首先要选择合适的荧光病毒。荧光染料或指示剂是通过病毒载体转入目标脑区，常用载体为AAV病毒。根据实验的不同，需要选择特异启动子或者Cre-FloxP系统来特异标记目标神经元，无特异性的GCaMPs表达虽然可以观测群体神经元活动但无神经元特异性，光纤记录的作用在于观测特异类型神经元群体的活动。

实验流程：

1、在目标脑区注射钙荧光病毒，并在注射位点埋植光纤插针，用于收集荧光；

图7：病毒注射与陶瓷插针埋植

2、待2-3周钙荧光病毒表达后，连接光纤，使用光纤记录系统采集动物在行为学实验中大脑的钙荧光信号；

图8：病毒表达

3、通过分析软件处理钙荧光信号数据，并结合行为学视频对动物的行为进行分析。

图9：光纤记录结合高架十字迷宫实验

三、光纤记录数据分析

以瑞沃德R820三色光纤记录系统记录的数据为例。

1、数据预处理。R820三色光纤记录系统软件集信号采集与数据分析于一体，在数据分析中，数据预处理过程包含平滑处理，基线矫正，运动矫正等功能。

平滑处理可以将数据中的过多杂信号去除，最大限度的突出目标peak。基线矫正多数针对的是荧光信号因长时间记录导致漂白信号逐步下降，或者光纤的自发荧光在长期记录下逐步被漂白基线逐步下降等情况。此情形的数据因为整体呈现下降趋势，不利于后续数据作图分析，所以需要进行基线矫正。运动矫正用于采用410nm对照通道的数据，410nm数据可以用于反应背景噪音信号，运动矫正即将410nm数据与470nm数据进行拟合，通过算法从470数据中去除410nm数据的波动，得到真实的荧光数据。

图10：光纤记录数据预处理

2. 将荧光数据与动物行为数据同步对比，选择事件标记或者增加事件标记，事件相关信号分析作图。

图11：事件分析

3. 将不同组的数据进行组间对比，即可分析不同处理因素下荧光数据的差异。此外，还可结合行为学视频同步分析动物的运动轨迹。

图12：不同数据组间分析

通过以上步骤，原始的荧光数据就可以直接出图啦。

光纤记录实验的工作原理，实验方法以及数据分析已经全部讲完啦….

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你在进行光纤记录实验时，是否有如下烦脑：

◆ 记录好的数据看着很杂乱，不知如何整理？

◆ 数据处理包含哪些步骤？

◆ 如何确定数据分析的baseline

◆ ΔF/F指的是什么？

◆ 信号出现了“漂白效应”怎么办？

无需困惑，对以上问题，我们最近总结了一份实操步骤，这份操作指南可帮你迅速上手数据处理

常见光纤记录数据处理过程

让我们来看一张原始数据案例图，下图显示数据整体波动过于密集，其中410nm对照通道数据不够稳定；对应事件标记（线条标记处）的peak也不是很突出，针对这种数据情况，我们立刻开始数据处理吧。

（▲本文实操分析案例图）

（*以下分析过程以瑞沃德双色多通道光纤记录系统操作界面为主要示例）

01.第 一步

我们将数据根据需要分析的时间段进行裁剪，此步骤也可跳过。

02.第二步

数据预处理。常见数据预处理过程包含平滑处理，基线矫正，运动矫正。平滑处理可以将数据中的过多杂信号去除，ZD限度的突出目标peak。如下图所示，原始数据经平滑处理后目标peak更加突出，更容易观察分析。

基线矫正多数针对的是荧光信号因长时间记录导致漂白信号逐步下降，或者光纤的自发荧光在长期记录下逐步被漂白基线逐步下降等情况。此情形的数据因为整体呈现下降趋势，不利于后续数据作图分析，所以需要进行基线矫正。如下图所示，基线矫正可以直接将下降趋势的数据通过算法拟合后恢复成平整状态。

运动矫正用于采用410nm对照通道的数据，410nm数据可以用于反应背景噪音信号，运动矫正即将410nm数据与470nm数据进行拟合，通过算法从470数据中去除410nm数据的波动，得到真实的荧光数据。当不选择运动矫正功能或者实验未记录410nm的数据，可以选择一定时间范围内的信号作为对照进行算法处理。

03.第三步

数据预处理后即可得到整体数据的ΔF/F或者Z-score，用于反应数据的波动幅度。二者采用了不同的算法，数据的呈现结果略有不同。

ΔF/F=（F-F1）/F0：

（1）当数据进行基线矫正后：

◆ 若对照选择为410，F1=fitted410，F0=median（raw data）

◆ 若对照选择非410：F1为基线矫正曲线值，F0=median（Baseline）

（2）当数据未进行基线矫正：

◆ 若数据对照为410，则F1=F0=fitted410，

◆ 若数据对照非410，则F1=F0=median（Baseline）

Z-score：

使用标准分数计算方式，即z-score=（x-mean）/std，x=ΔF/F，mean为ΔF/F的均值，std为相应标准差。

04.第四步

将荧光数据与动物行为数据同步对比，选择事件标记或者增加事件标记。

05.第五步

选择事件分析的时间区间和baseline区间，用于事件相关信号分析作图。

06.第六步

将不同组的数据进行组间对比，即可分析不同处理因素下荧光数据的差异。

通过以上步骤，原始的荧光数据就可以直接出图啦。

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（▲瑞沃德双色多通道光纤记录系统）（▲瑞沃德双色多通道光纤记录系统）

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LCR数字电桥是用来测量电感、电容、电阻参量的仪器，通常包含Z，Y，θ，Rs，Rp，X，G，B，Ls，Lp，Cs，Cp，Q，D等测量项目，为什么要测量阻抗呢？今天安泰测试就给大家科普一下LCR数字电桥：

什么是阻抗？

在具有电阻、电感和电容的电路里，对电路中的电流所起的阻碍作用叫做阻抗。不管是数字电路工程师还是射频工程师，都在关注各类器件的阻抗，比如在音响器材中，阻抗是常常提及的重要参数。

阻抗常用Z表示，是一个复数，实部称为电阻，虚部称为电抗，其中电容在电路中对交流电所起的阻碍作用称为容抗 ，电感在电路中对交流电所起的阻碍作用称为感抗，电容和电感在电路中对交流电引起的阻碍作用总称为电抗。

电阻，电容，电感的阻抗计算公式：

XR=R；

XL= wL =2πfL；

XC==1/（wC）= 1/（2πfC）；

LCR数字电桥原理

初期的阻抗测量用的是电桥方法，如图，随着现代模拟和数字技术的发展，现代阻抗测量大都使用自动平衡电桥法，不仅测出阻抗，还可以直接显示L-Q,C-D,R-D和Z-Q电感电容值参数等。

选型方法

LCR数字电桥根据被测器件需要的频率、电平进行主机选型；

LCR数字电桥根据被测器件封装进行夹具选型；

LCR数字电桥根据被测器件是否需要直流偏置，选配偏压盒、偏流盒； 

测试技巧

1、什么时候加偏压盒？

当需要测试带有直流偏置的元器件时，比如二极管的导通电容，需要加偏压测试；类似的，在需要加直流电流偏置时，可以选用偏流盒；

2、品质因子Q和损耗因子 D的电学含义：

电感器的品质因子Q是表明器件接近纯电抗的程度，品质因子越大，说明电抗的值越大，实部串联电阻越小，能量损耗小。

对于电容器来说，表示纯度的这一项通常用耗散因素(D)，D=1/Q；因此D越小，电容容抗越大，效能越好。

3、LCR表的内阻30、50、100Ω如何选择？

为了降低铁心材料的非线形，测电感一般用大内阻100欧姆，降低测试信号电平；为了与其他家型号的测试仪进行数据对比，必须保证与其有相同的信号源内阻模式。其他阻抗为可提供的选择，与厂家规定的内阻测试条件一致即可。

30 Ω可类比于：CH107X/GR1689

100 Ω 可类比于：HP4284A/E4980A/Chroma3250

10 Ω/CC可类比于：CH106X/WK3245

50 Ω可类比于：HK3532

另外，10/100内阻模式：当用户需要用 100kHz 测量 1uF~10uF 的CBB的损耗时，可以使用这种内阻模式，可以提高测量结果特别是损耗因子的稳定性。

4、 为什么说LCR 电桥很难测高Q和低D器件，比如MLCC片式多层陶瓷电容器？

LCR电桥 Q值和 D值测量是依据如下图原理公式计算得来：

假定 Q = 10，0 则 ESR 为 1/100 的 XL。可见，ESR 在 Z = ESR + j*X中L 占的分量比较小，所以仪器或测量环境引起 ESR 微弱的变化都会被放大 100 倍，反应出的现象就是：Q 值稳定性不好或测量数据跳动较大。同样的道理也适用于电容 D 的测量。

用户能做的就是尽量选择好一点的测试夹具改善效果，原则：能用 0m 的不要用 1m 的，能用 4 端测量不要用 2 端测量。

本文由安泰测试整理发布，欢迎各位关注微信公众号“安泰测试”留言探讨，更多仪器知识欢迎访问安泰测试网。

光纤记录实验操作较为简便，能够长时间稳定的动态检测动物的神经信号，目前在神经科学研究中应用越发广泛。但是在做光纤记录实验中，有时会遇到采集不到荧光信号的情况，各位小伙伴是否也曾遇到过？今天，小沃带大家梳理一遍采集不到信号的可能原因及实验注意事项，助你实验更顺畅！

01病毒

1.病毒是否存在反复冻融现象，反复冻融会降低病毒滴度，从而影响病毒转染效率。因此光纤记录实验中，病毒应即拿即用，避免冻融。

2.病毒与目标脑区神经元特异性结合程度也会影响荧光信号。

02病毒注射

1.手术前定位：通过预实验对脑区精准定位（可通过台盼蓝注射定位）。在病毒注射前，我们可以先注射台盼蓝进行预实验以达到练手的目的，提高后面实验的成功率。

脑区坐标定位参考：调平时注意左右高度差小于0.03mm。

2.病毒注射：选择较细直径的玻璃电极可以减少注射损伤，对于浅层脑区注射，可减少病毒泄露。病毒注射后留针10min。

3.病毒注射检测：切脑片看荧光表达。

荧光染色实验拍不出带有荧光的细胞，可能原因是显微镜聚焦未在神经细胞这一层上（如上图出现模糊团状，可能会是细胞）、注射的脑区与病毒反应的特异性神经元数量太少、或是荧光淬灭掉了。

注意事项：

如果病毒没注射成功，可能原因有手术中脑区定位有偏差导致病毒注射位置不对（目标脑区很小的话会常存在这个问题）、病毒注射后顺着脑室流走、病毒注射后未留针导致病毒顺着注射孔被析出。

03陶瓷插针埋植位置

1.病毒注射与陶瓷插针植入可以在同一个手术进行，避免二次手术对小鼠造成伤害；

2.选择合适的夹持器，满足不同深度及相对距离的植入手术；

3.定期查看定位仪操作臂与夹持器的固定情况，防止角度偏差。

病毒注射表达区域与陶瓷插针的植入位置需要保持接近，根据文献中数据，超过100µm就会明显影响信号强度。

HanQin et al., Neurophoton,2019

04耗材参数搭配

1.光纤记录实验对环境光比较敏感，建议实验在光线相对稳定、昏暗的环境下进行。光纤记录更适合选择黑色陶瓷插针与黑色陶瓷套管，可避免环境光对荧光信号的影响；

2.较大数值孔径的耗材有助于荧光信号的传输，所有的配件耗材保持相同的芯径、NA数值更有助于实验记录；

3.使用高强度的激光器对光纤进行漂白，使得光纤等耗材的自发荧光降低，减少噪声干扰。

光纤漂白器

05光纤记录参数设置

1.首先检查线路连接：包括光纤与机器连接的端口，光纤与小鼠连接的端口（并使用酒精擦拭光纤端口和镜头）。

2.调高曝光时间：Cmos相机拍摄时间增加，有助于采集到荧光信号。

注意事项：

1.若未记录到信号，可适当调高光源功率；

2.动物脑区较大，病毒注射量可适量增加；

3.病毒注射后也可先不埋植插针，待2-3周后病毒表达，陶瓷插针连接光纤一起植入，边植入插针边检测钙信号。

瑞沃德三色多通道光纤记录系统

产品特点：

• 最大支持9通道同时采集，满足多只动物或多个脑区位点同时实验；

• 高灵敏双检测器，独立分时序采集，避免荧光串扰；

• 专业集成信号采集、数据分析、行为学采集分析模块；

• 输出信号参数自定义调节，可进行多种触发，实现刺激和记录的闭环控制；

• 兼容光遗传学，实现同一位点记录和刺激。

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无论您是近红外光谱分析技术的新手，还是经验丰富的老手，亦或只是对它感到好奇，瑞士万通都将帮助您了解如何使用近红外光谱进行理想的分析。下面我们将介绍一些关于瑞士万通实验室近红外光谱分析仪的常见问题。

问题概览

1.   红外光谱和近红外光谱有什么区别？

2.   为什么说近红外光谱是一种辅助技术？

3.   什么是预测模型，需要多久建立或更新一次？

4.   建立预测模型需要多少样品？

5.   哪些标准阐述了近红外光谱在制药及其他行业的使用？

6.   对于液体和固体样品的检测限分别是多少？

7.   近红外光谱的准确度如何？

8.   仪器如何校准？多长时间校准一次？

9.   仪器如何验证？多长时间验证一次？

10.  什么类型的样品或参数不适用于近红外光谱分析？

红外光谱和近红外光谱有什么区别？

红外光谱和近红外光谱利用的是不同的光谱范围。近红外光的能量高于红外光，这会影响其与样品中分子的相互作用。这种能量差异既有优点也有缺点，理想分析技术的选择在很大程度上取决于应用本身。

大多数有机材料对高能量近红外光的吸收比红外光少，因此拓宽了产生的谱带，使得在没有进行数学处理的情况下很难将其分配到特定的官能团。

近红外光谱无需任何样品前处理即可进行分析，无需制备分析物薄片或使用 ATR（衰减全反射）。

近红外光谱还可测定高达15%的水含量。

为什么说近红外光谱是一种辅助技术？

近红外光谱是通过模型进行定性或定量分析,是一种间接分析技术,所建立的模型质量会直接影响分析结果。

由于近红外光谱的分析结果很大程度上取决于模型开发过程中的参考值，因此，近红外光谱是一种辅助技术。

什么是预测模型，需要多久建立或更新一次？

预测模型是通过将样品的近红外光谱与使用参考方法（如，用于水分测定的卡尔费休滴定法）获得的参考值相结合而建立的数学模型。日常分析中，预测模型通过解析样品的近红外光谱来确定关键质量参数的值，如：水分含量、密度、总酸值等。

预测模型由足够的代表性光谱和参考值组成，通常只需要建立一次模型，后期如果样品发生变化才需要更新模型，如：生产工艺设备或参数、原料供应商等发生变化。

建立预测模型需要多少样品？ 

一个稳健的预测模型所需的样品数量取决于样品基质的复杂性和关键参数的分子吸收率。

对于简单基质的样品，如：卤化溶剂中水分含量的测定，可覆盖预期测量范围的10-20个样品光谱就足够了。

对于较为复杂的应用，建议使用至少40-60个光谱，以便建立稳健可靠的预测模型。

哪些标准阐述了近红外光谱在制药及其他行业的使用？ 

阐述制药行业如何使用近红外光谱系统的标准为：USP<856> 和 USP<1856>。

对于其他行业，如何建立预测模型以及对近红外光谱系统的基本要求的通用标准是ASTM E1655；方法验证和仪器验证的标准分别是ASTM D6122和ASTM D6299。

对于燃料中 RON 和 MON 等的测量，应遵循 ASTM D2699 和 ASTM D2700 等标准。

对于液体和固体样品的检测限分别是多少？ 

检测限取决于分析的物质、样品基质的复杂性以及所使用参考技术和近红外技术的灵敏度。

色散型近红外光谱系统尤为灵敏，如果使用色散型近红外光谱系统来分析简单样品，且待测参数是一个强吸收剂，则将实现较低的检测限。

溶剂中水的检测限低至约 10mg/L；对于较为复杂的基质（如，固体和浆液），水的检测限约为 1000mg/L（0.1%）。

近红外光谱的准确度如何？

近红外光谱方法的准确度取决于所使用参考方法的准确度。

高准确度的参考方法将获得高准确度的近红外光谱方法，反之，低准确度的参考方法则会降低相关近红外光谱方法的准确度。这是因为近红外光谱数据和参考数据在预测模型中是相关联的。

良好的预测模型的准确度约为参考方法准确度的1.1倍。

仪器如何校准？多长时间校准一次？ 

使用经认证的 NIST 标准品对仪器进行校准。

在反射模式下：使用 NIST SRM 1920 标准品校准波长/波数轴，使用经认证的反射标准品（具有确定反射比的陶瓷片）校准吸光度轴。

在透射模式下：使用 NIST SRM 2065 或2035校准波长/波数轴，使用空气校准吸光度轴。

每次硬件维修（如，更换灯源）后应进行仪器校准，并将校准作为仪器维护保养的一部分，每年进行一次。理想情况下，光谱仪软件可引导用户完成整个校准过程。

仪器如何验证？多长时间验证一次？

近红外光谱软件可提供不同的测试来验证仪器的性能。其中较为常用的是基本性能测试，主要测试系统的一些关键硬件、波长/波数校准、信噪比（S/N）。

对于制药行业，通常根据 USP<856> 指南进行进一步测试，包括高光通量和低光通量下的光度测量线性和噪声。

仪器性能测试应定期进行，其频率取决于风险评估。

什么类型的样品或参数不适用于近红外光谱分析？

一般情况下，含有大量炭黑的样品无法通过近红外光谱进行分析，因为炭黑可吸收几乎所有的近红外光。

大多数无机物质在近红外光谱区域没有吸收带，因此不适合进行近红外光谱分析。

注：在实际应用中，瑞士万通已使用 DS2500 近红外光谱固体分析仪成功开发了煤质分析的相关应用。

光纤记录（Fiber photometry）通过时间相关单光子计数(TCSPC)的光纤光学来测量荧光分子在大脑中发出的光信号。基于基本原理，使用直径较小的光纤探头就能实现传输并收集荧光信号，将采集到的发射信号通过二色镜进行光谱分离，并通过滤波器聚焦到探测器上，即可检测出荧光的实时动态变化。

所以光纤记录方法的优势主要在于：

1. 植入的光纤探头体积小且柔韧性好，使得周围组织损伤较小；

2. 因为植入光纤体积小，方便同时记录多个大脑区域的信号；

3. 基于TCSPC的光纤是检测发射光的超灵敏工具，满足在低强度激发光下即可检测荧光，从而减少了光漂白的机会，并延长了记录时间。

目前光纤记录常用于检测钙信号及神经递质信号变化，背后原理是通过给实验动物注射基因编码型的荧光探针/生物传感器，随后通过光纤记录即可检测到对应神经信号的变化。基因编码生物传感器是一类生物分子信号介质，它被整合到细胞的基因组中，然后由细胞的分子机制产生。这些蛋白质结构可以被设计成在化学物质存在或细胞环境变化时改变构象，从而产生荧光信号。

常见的基因编码型的生物传感器根据应用场景主要分为：

1、膜去极化。一旦动作电位(AP)被激活，AP将沿轴突向下传播，并使突触前钮扣对应的膜去极化(从−65 mV到+40 mV或更大)。这种膜去极化作为神经元激活的分子特征，可以通过遗传编码的电压指示探针(GEVIs)检测；

2、电压门控Ca2+通道激活和输入。当膜去极化发生在突触前活跃区，电压门控Ca2+通道打开，导致Ca2+快速内流。这种升高的细胞质Ca2+浓度(从~100-~400nM)的变化可以持续约50-150毫秒，通过基因编码Ca2+指示剂(GECIs)即可检测；

3、膜泡融合/胞外分泌。胞质Ca2+水平升高触发易于释放的突触囊泡的胞外排泄，这些突触囊泡充满了神经递质。在胞外分泌过程中，当突触囊泡与质膜融合时，细胞外介质(pH ~ 7.4)中和囊泡腔(pH ~ 5.5)的酸性pH值，这种中和作用可以通过pH值指标探针检测，如pHluorin；

4、神经递质传递。一旦神经递质被释放到突触，它们的功能根据递质类型而异，可以通过神经递质(NT)指标检测，如iAChSnFR和 dLight。基因编码型乙酰胆碱(ACh)探针iAChSnFR用于检测不同生物样品中的ACh瞬变。它被设计成在胆碱结合时发出荧光，并被证实可用于测量小鼠体内奖励活动中海马ACh传递的反应。dLight是一种基于受体的遗传编码多巴胺(DA)荧光探针。它是通过用环状排列的绿色荧光蛋白(cpGFP)取代DA受体(DAR)的第三个胞内环（Intracellular Loop 3，ICL3）的位置而构建的。dLight产生不同的荧光强度对应于DA与DAR的结合量。

图1所示：光纤记录系统原理和基因编码荧光探针。

A.光纤记录装置和信号处理的原理图。在该模型中，将基因编码的荧光探针病毒注射到腹侧被盖区(VTA)，投射的信号从伏隔核(NAc)和前额皮质(PFC)记录下来。

B.四种不同的基因编码型探针及其对应的神经传递分子信号的示意图表示。随着动作电位(AP)的传播，电压门控钙(Ca2+)通道被触发打开，导致快速的Ca2+内流；随即诱导突触囊泡的胞吐，突触囊泡将神经递质(NTs)释放到突触间隙，在突触间隙中神经递质可以与相应的受体结合并激活突触后神经元，这些分子特征可以通过电压指标(GEVIs) ，Ca2+探针(GECIs)， pH值指标探针(如pHluorin)，NT指标探针(G protein-coupled受体,GCPR)进行检测。示意图非真实比例。

光纤记录实验操作较为简便，目前在神经环路分子机制探究上应用越发广泛，同时越来越多的实验室将光纤记录与其他实验技术进行联合应用。

1、光纤记录与光遗传

光遗传学是一种以光作为工具特异性激活或抑制神经传递的方法。研究人员经常使用光遗传学以极大的时间精确度来研究确定的神经元亚群对特定行为的影响。但是光照的作用仅仅通过动物行为的检测评估是不完善的，很有可能存在“假阳性”和“假阴性”，且不能排除自然行为的干扰。而光纤记录即可提供足够的证据支撑。光遗传学结合光纤记录的方法使研究人员能够研究特定细胞、它们的投射关系的功能意义。

2、光纤记录与核磁

一般认为，血氧水平检测(BOLD) fMRI(功能性磁共振成像)通过血管耦合机制与神经传递在时空上相关。为了更深入地了解神经元对BOLD信号的贡献，电生理学技术已被纳入功能磁共振成像研究。虽然这些研究提供了关于神经元环路更具体的信息，但功能磁共振成像(fMRI)所需要的磁场会在电生理信号中产生伪影。

而近几年的研究中将光纤记录和fMRI相结合，证明了Ca2+峰值和不同大脑区域的BOLD信号之间的联系，同时有文献证明星形胶质细胞Ca2+水平的变化与BOLD信号也有关联。fMRI技术与光纤记录相结合，使fMRI扫描具有细胞分辨率。这种综合技术有潜力阐明单个神经元亚群对大脑回路的贡献。

图2所示：将BOLD fMRI技术与细胞-特异性病毒传递的GCaMP6（一种遗传编码的钙指示剂，GECI）的光学检测技术相结合（Schlegel et al .,Nature protocols(2018)）

3、光纤记录与电生理

目前，电生理学是研究行为与自由行为动物体内神经元动力学关系的金标准分析技术。电生理学允许同时记录数百或数千个细胞、离子通道和神经元活动，电极可以落在单个细胞上，记录细胞内信号变化，或者落在细胞外空间，监测整个大脑区域的电生理信号。它测量的电信号（电流或电位）以高时间分辨率的毫秒级离子通量导出。

电极阵列记录来自电极尖端附近所有细胞的信号，不能直接区分细胞种类。由于光纤记录方法缺乏较高的时间分辨率，在体电生理学缺乏细胞类型特异性，二者结合有助于高时空分辨率下研究不同的大脑区域特定环路和行为状态。

R820三色光纤记录系统，可记录GCaMP、dLight等绿色荧光指示剂或递质探针，及RCaMP、jrGECO1a等红色指示剂或递质探针信号，同时特有的410nm光源用于获取对照信号，有效排除噪声。灵活的TTL信号输入输出设置，更方便拓展实验应用。

R820三色多通道光纤记录系统

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光纤记录系统作为常用的研究动物神经元活动与行为关系的重要工具，对于研究特定神经环路在不同行为范式中的功能具有重要意义。本文将着重介绍光纤记录实验手术所需器材，手术步骤以及注意事项，助力实验数据准确性的提升。

实验设备和材料

异氟烷麻醉系统、立体定位仪、数码显微镜、电极拉制仪、微量注射泵、剃毛工具、手术刀、眼科镊、眼科剪、棉签、碘伏、3%双氧水，AAV病毒、陶瓷插针、颅骨钻、钻头（0.8mm）、颅钉（M1.0xL2.0mm）、螺丝刀（45*1mm）、生理盐水、牙托粉水（义齿基托聚合物，自凝型）、红霉素眼膏、抗生素等。

术前准备

01

确定目标脑区坐标

确定目标脑区位点通常有两种策略：

• 通过使用立体定位图谱，寻找目标脑区具体位置，读取目标脑区深度，矢状、冠状坐标，最终确定目标脑区的三维坐标。

• 通过阅读参考文献，获取方法中涉及目标脑区的坐标。文献中坐标常用标注：AP：anteroposterior，前囟前后；ML：mediolateral，中缝左右；DV：dorsoventral，颅骨（硬脑膜）平面向下。

*需要注意：文献中坐标选取的Z轴参考点：包括Bregma点、脑膜表面、颅骨表面的Z轴读值

02

器具消毒、仪器检查

实验前使用酒精擦拭手术器械，检查各种实验耗材是否准备完整。检查立体定位仪，确保定位仪刻度置零，可以正常工作。

03

实验动物准备

选取实验动物检查其健康状况。

（▲小鼠颅骨表面示意图）

动物手术

01

动物麻醉及固定

1. 小鼠称重。

2. 在异氟烷诱导盒中麻醉小鼠（4％，1 L / min）。

3. 将小鼠嘴部放在麻醉面罩中。

4. 将小鼠门齿扣在适配器齿棒上，并使用适配器将小鼠固定于立体定位仪上，异氟烷浓度调整为0.5-1%。

5. 麻醉深度可通过对脚趾捏合无反应（监测脚趾捏合反应）来确认，手术期间每20min一次。

6. 剃掉从眼睛到耳朵后面的毛发。

7. 用棉签蘸少量碘伏清洁头部。

8. 在头皮表面下注入0.1 ml利多卡因，以提供局部镇痛作用。

9. 保护眼睛避光：涂抹红霉素眼膏。

（▲手术前小鼠）

02

暴露颅骨

1. 从前到后（眼睛之间到颅骨后部）做切口。

2. 用蘸有生理盐水的棉签擦拭切口。

3. 找到并标记Bregma（前囟点）位置。

4. 确保头骨干净（没有血液，毛皮或组织）并且干燥（使用干燥的棉签吸生理盐水或血液）。

5. 将连接好玻璃电极的微量注射泵夹持到定位仪上。

6. 调节颅骨水平：玻璃电极针尖接触Bregma点，将该点设定为原点，而后测量Bregma点左右两侧旁开2.3mm处颅骨的高度差，小于0.03mm则认为左右颅骨水平，大于0.03mm则需要调节耳杆的高度来调整水平，前后方向测量Bregma点和Lambda点的高度差，也需小于0.03mm，若大于0.03mm则上下调整鼻夹的高度（注意：移动颅骨后需要重新定Bregma点）。

7. 标记目标位置。

8. 在目标标记点处用颅钻进行开颅并挑开硬脑膜。此外还需钻两个预留孔，用于埋植颅钉。如果钻孔过程发生出血，使用棉签清洁血液，然后使用一块可吸收的海绵来止血。

9. 用盐水浸湿的海绵覆盖开颅部位。

03

病毒注射

1. 从冰箱中取出病毒。

2. 设置微量注射泵参数（例如吸取体积400nL，速度为800nL/min，模式调为吸入Withdraw）吸取病毒，使其尖端接触Bregma点并设定原点。

3. 取走开颅部位湿海绵。

4. 将玻璃电极针移动至目标位点上方，然后下针至目标位点（下针过程保持匀速缓慢），设置注射泵参数（体积400nL，速度40nL/min，模式调为泵出Infuse）,开始注射病毒。

5. 注射完成后静置10min，10min后将微量注射器抬起。

6. 瑞沃德R480玻璃微电极注射泵搭配立体定位仪，对脑部可精准进行病毒或示踪剂注射。

04

埋植颅钉

颅钉（小螺丝）植入深度约0.5mm左右，避免过深压迫大脑，过浅固定不牢固。固定颅钉的预留孔需离光纤埋植的位置远一些，防止颅钉埋好之后留下的空间太小，导致光纤不好埋植。颅骨钻孔完成后，还需清理颅骨表面的颅骨碎屑，并用生理盐水清洗，保证颅骨表面清晰干净。

（▲颅钉植入）

05

陶瓷插针植入

1. 在病毒注射后，从脑立体定位仪上取下注射泵。

2. 将光纤插针用夹持器固定到脑立体定位仪上。

3. 固定光纤之后需要用光纤尖部接触Bregma点，重新移动至目标位点上方（光纤插针应位于钻头产生的窗口上方）。

4. 将光纤插针下降到适当的DV坐标，高于病毒注射位置200-300μm。

5. 用牙科水泥固定光纤。注意：牙科水泥轻轻涂抹在光纤纤维的底部周围。

6. 待水泥完全凝固后，小鼠转移至饲养笼中单独饲养，术后监测健康情况。

光纤记录实验

待2-3周钙荧光病毒表达后，将光纤与小鼠头部陶瓷插针连接，使用光纤记录系统采集动物在行为学实验中大脑的钙荧光信号，通过分析软件处理钙荧光信号数据，并结合行为学视频对动物的行为进行分析。

（▲光纤记录实验）

光纤记录实验手术中所需器材、手术步骤和注意事项已全部讲解，后续我们还有更多光纤记录干货，请持续关注哦~

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1、什么是PCR

PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，其是一种用于放大扩增特定的DNA（或RNA）片段的分子生物学技术。这种技术模拟体内DNA的天然复制过程，能将微量的DNA进行特异性的扩增，在短时间内获得足够的DNA，是分子生物学研究中不可缺少的一员。

2、标准PCR的过程

此项技术是模拟DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，在整个PCR过程中包含了变性——退火（复性）——延伸三个基本反应步骤。

• DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

• 退火（复性）（40℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

• 延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

3、为什么要使用梯度PCR仪呢

梯度PCR仪是指一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件的仪器，因为不同的DNA片段其最适退火温度不同，采用梯度PCR仪通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适退火温度，优化反应条件，进行有效的扩增。

在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。

使用普通的PCR仪进行扩增时，只能运行一个特定的退火温度，当目的基因的退火温度不适时，就可能出现假阳性，影响实验结果。而对于梯度PCR仪，不但可以作为普通PCR仪使用，也可以通过设置不同的温度梯度（通常为12个梯度温度），研究未知DNA退火温度的扩增，有效降低或避免假阳性，同时在不理想的工作条件下扩增出产物，既节约成本也提高了实验效率。

适用于分子生物学、微生物学、遗传学、细胞生物学、食品科学和农学等领域，进行分子克隆、基因表达分析、基因型鉴定、测序、病原微生物分析等实验研究。

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Hello everybody，上次的光遗传耗材选购小贴士文章得到了大家广泛的认可与支持！

本着做事就要细致的原则，说了光遗传怎么会少了光纤记录呢？

本文来袭，一文让你看懂光纤记录实验如何选择合适的耗材配件！

首先我们看一下光纤记录的原理，光纤记录通过时间相关单光子计数(TCSPC)的光纤光学来测量荧光分子在大脑中发出的光信号。基于基本原理，使用直径较小的光纤探头就能实现传输并收集荧光信号。

▲光纤记录工作原理

光纤记录系统是目前常用的神经元群体荧光信号检测工具，其特点是能通过光学技术记录特异性神经元在特定行为范式中的活性变化，实验多数通过给动物注射携带荧光蛋白的探针，例如GCaMP、RCaMP、jrGECO1a、DA1h等，同时在注射部位埋置200-400μm的光纤陶瓷插芯，用于传送激发光和收集发射光。激发光经过光纤跳线和动物头部陶瓷插芯后到达特定脑区，激发荧光蛋白的荧光，被激发的荧光信号的强度可以被植入动物脑内的光纤末端收集，收集到的荧光经传感器转换为电信号，随后经数据采集卡被传送至记录系统，以达到实时观察所研究脑区一群神经细胞信号活动的目的。

而光纤记录的发展历史从之前最常用的PMT探测器，再到CCD相机，到现在最流 行的CMOS相机，整体的检测通道数，检测速度因为探测器的更新得到了更大的提升。同时内部光路从激光再到现在最常用的LED光源，激发光功率逐渐降低，从而避免了光漂白效应的产生，实现长时程记录。

从以上内容我们可以得知，光纤记录通过同一根光纤和陶瓷插针即可实现传输激发光和收集荧光信号，同时激发光的功率较低（微瓦级别），如何选择合适的配件耗材才能达到最大效率的信号传输呢？

敲黑板，重 点来了（搬起小板凳认真听）

1.耗材芯径，数值孔径（NA）怎么选择？

光纤，陶瓷插针需要选择相同的芯径及数值孔径，同样参数规格下，可以避免传输光的损耗。若整体连接中耗材参数不一致，例如插针的芯径大于光纤芯径，就会导致激发光的传输不受影响而发射光的收集大大损耗。

2.光遗传实验的陶瓷插针可以用于光纤记录吗？

二者可以通用。陶瓷插针的自发荧光很低，对于光纤记录实验没有影响。但是光纤记录更推荐黑色款陶瓷插针和黑色陶瓷套管，可以更好避免环境光的干扰。

▲黑色款陶瓷插针

3.光纤的材质是否有特殊要求？

光纤根据原料不同，自发荧光数值也会有些差别。普通光纤使用前需要用光纤漂白器进行漂白，每次漂白时间为1.5小时以上，漂白后可以减少50%-75%的自发荧光，但是自发荧光会随着时间逐渐恢复，所以下次使用之前需要重复漂白。

▲R810-1光纤漂白器

低自发荧光光纤采用低自发荧光材料制作而成，整体的自发荧光值就很低，实验中不需要重复漂白。在检测一些较弱信号情况下，低自发荧光光纤更具有优势。

4.光纤记录实验能否搭配光纤旋转器？

光纤旋转器是一种实现光旋转连接的光学器件，在实验中可以避免动物运动导致的光纤缠绕。光纤旋转器主要参数分为插入损耗率，旋转变化量，通光率等。常见的光纤旋转器可用于光遗传实验，用于清醒自由动物长时间的刺激和观测实验。

但是光纤记录的激发光和发射光能量都偏低，使用旋转器会对信号传输产生影响，在微弱信号检测上具有影响，所以在绝大多数实验场景下，我们不推荐使用。

如果实验动物运动过于强烈或者某些特殊实验场景（多动物社交实验等）下，可以选择光纤记录专用转环完成实验（具体可以咨询瑞沃德销售同事）。

5. 多通道记录如何选择光纤耗材？

光纤记录仪器通过同一个接口即可实现多通道记录，所以多通道记录实验可以选择搭配多通道光纤。

▲多通道光纤

6.芯径越大，数值孔径（NA）越大，是不是实验效果更好？

结合第 一个问题，整体耗材上下游需要保持相同的芯径和数值孔径，从而可以实现最高效率的光传输与记录。在保持相同参数下，提高数值孔径和芯径可以扩大进光面积，一定程度上提高信号水平。因为芯径越大对于动物脑部的损伤也会大一些，在小鼠实验中，200微米，NA0.39参数即可满足绝大多数实验需求。

如果实验测试时没有完全匹配的光纤，建议选择数值孔径或芯径大于陶瓷插针的光纤，此类情况下，可以适当提高激发光的功率从而达到最 好的激发效果，而发射光的回传不受影响。

7.实验如何最大程度避免环境光的干扰？

选择黑色陶瓷插针，黑色套管，黑色包层光纤可以最大程度避免环境光的干扰。此外还可以将牙科水泥涂黑，从而降低环境光的透入。

本期的光纤记录耗材小贴士就到这里啦！

瑞沃德光纤记录系统包含全套实验所需的配件耗材，只需选择一个型号，就可让实验“一步到位”，让您的实验更省心!

R820三色多通道光纤记录系统，可记录GCaMP、dLight等绿色荧光指示剂或递质探针，及RCaMP、jrGECO1a等红色指示剂或递质探针信号，同时特有的410nmLED用于获取对照信号，排除噪声，可支持定制不同规格的光纤和陶瓷插芯，满足多样化实验需求。

主要功能：

主要用于半导体应用，及各种需要进行微纳工艺溅射镀膜的情形。可以用于金属材料（金、银、铜、镍、铬等）的直流溅射、直流共溅射，绝缘材料（如陶瓷等）的射频溅射，以及反应溅射能力。基片可支持硅片，氧化硅片，玻璃片，以及对温度敏感的有机柔性基片等。

工作原理：

通过分子泵和机械泵组成的两级真空泵对不锈钢腔体抽真空，当广域真空计显示的读数达到10-6Torr量级或更高的真空时，主系统的控制软件通过控制质量流量计精确控制Ar气体(如需要溅射氧化物薄膜，可增加O2)，此时可以设定工艺所要求的真空（一般在0.1-10Pa范围）。这时可以根据溅射的需要开启RF或DC电源，并通过软件选择所要溅射的靶枪，产生的Ar等离子轰击相应的靶枪(如果增加O2，氧原子则会与溅射出来的原子产生反应，实现反应溅射)。并在样品台上方的基片上沉积出相应的薄膜，薄膜的膜厚可以通过膜厚监控仪自动控制。工艺状况可通过腔门上的观察视窗实时观看。自动遮板则可以遮挡每一次除了被选中的靶枪外的其它靶枪，防止被污染。

设备优势：

考虑实验应用要求工艺数据的可靠性，NANO-MASTER的磁控溅射设备在镀膜均匀性、重复性和设备稳定性等方面均有优势。

1、镀膜均匀性：在关键的镀膜均匀性方面，对于6”硅片的金属材料镀膜，NM设备可以达到优于3%的镀膜均匀度。

2、设备制造工艺：在配备相似等级的分子泵及机械泵的情况下，NM设备普遍具有更快的抽真空速率，可在20-25分钟左右就达到高真空工艺。腔体真空的稳定度影响镀膜的性能。

3、工艺的可重复性：NM设备在工艺控制方面，有更高的自动化能力，通过PC控制，减少人工干预造成的工艺偏差。相比需要人工配合的设备，导致不同人采用同样的工艺做出来的效果却不同，甚至同一个人在不同时间运行相同的工艺做出来的效果也不同。

4、设备的紧凑性：在满足相同性能情况下，由于加工精密度方面的优势，NM设备具有更紧凑的设计，占地面积较小，节约实验室宝贵的空间。

5、设备的稳定性：NM设备的维护率较低，可以保证设备较长时间的稳定运行，保证科研进度。

激光切割机是集光、机、电一体化的激光加工设备，它采用激光技术及计算机控制技术和高性能的数控激光电源系统，能快速GX地加工各种规格的金属板材。由于激光器性能优越，光电转换效率高，产生的热量小，所以只需配备小功率激光冷水机即可满足设备运行要求，能耗更低。

一、机床描述

激光切割机是集光、机、电一体化的激光加工设备，它采用激光技术及计算机控制技术和高性能的数控激光电源系统，能快速GX地加工各种规格的金属板材。由于激光器性能优越，光电转换效率高，产生的热量小，所以只需配备小功率激光冷水机即可满足设备运行要求，能耗更低。

二、设备组成

（1）的IPG光纤激光器和激光电源

我公司光纤激光切割机均采用高水平的IPG激光器，其性能稳定，关键部件使用寿命可达10万小时，设备整体质量得到安全保障。激光器可以产生zhuo越的光束质量，切割线条更精细，工作效率更高，加工质量更好。

（2）光纤专用激光切割头

设备采用德国技术的光纤专用激光切割头，配合电容非接触式自动系统，可以自动调整佳的焦距，保证整板佳的切割效果，即使材料表面不平整仍可以保证切割质量，切缝平整、美观；高速电容传感切割间距低，提高切割性能并减少气体消耗。

（3）控制系统机床床身：采用优质钢材焊接而成的框架结构，经过专业的焊接、高温退火，二次时效处理、大型龙门铣床精密加工，这些设计和加工手段确保机床具有优良的抗震性、高刚性和稳定性。

设备采用GX的HE数控软件，功能强大，兼容性强、能兼容NC文档、DXF、PLT、Al等制图软件格式。操作维护方便，在电脑上画出任面图像，不需开模，产品马上就可以出来，省时省钱。选配套料编辑软件，大限度地提高材料的利用率及切割效率。强大的图形显示功能，直观表现切割效果，在线监测切割路径。具有方便的自动记录位置、断点切割回退功能。

由于激光器性能优越，光电转换效率高，产生的热量小，所以只需配备小功率激光冷水机即可满足设备运行要求，能耗更低。

（4）机床系统

机床采用龙门式机械结构，横梁、床身整体加工，设备精度高、刚性好，运行平稳；同时结构紧凑，占地面积小，操作维护方便，可以满足工业24小时生产需要。

机床床身：采用优质钢材焊接而成的框架结构，经过专业的焊接、高温退火，二次时效处理、大型龙门铣床精密加工，这些设计和加工手段确保机床具有优良的抗震性、高刚性和稳定性。

传动系统：机床系统配备进流伺服系统及驱动系统，机床传动采用进口齿轮齿条传动结构，直线导轨导向，保证设备的高速度、高精度、高可靠性。传动系统：机床系统配备进流伺服系统及驱动系统，机床传动采用进口齿轮齿条传动结构，直线导轨导向，保证设备的高速度、高精度、高可靠性。

气路系统：切割气体分三路控制，可以实现打孔过程中的自动切换、氧气的压力实时控制和灵活的切割工艺调整。

（5）冷却系统

由于激光器性能优越，光电转换效率高，产生的热量小，所以只需配备小功率激光冷水机即可满足设备运行要求，能耗更低。

(文章由 光纤激光切割机 http://www.6618cnc.com/ 整理发布,文章内容仅供参考)