仪器网（yiqi.com）欢迎您！

研究背景：

慢性肾病（CKD）如果不加治 疗就会进展到晚期肾病（ESRD），ESRD的典型症状是尿毒症、代谢性酸中毒、贫血、电解质失衡和内分泌紊乱。根据NIH的报道结果，全 球约有两百万ESRD患者需要治 疗(National Institutions of Health, 2018)，且这个数字仅占需要治 疗病人的1/10 (Couser, Remuzzi, Mendis, & Tonelli, 2011)，每年新增的CKD患者以5-7%的比例增长 (University of California San Francisco, 2020)，因而广大的CKD或ESRD患者需要得到有效治 疗。针对ESRD，目前一般有2种治 疗方法，血液透析（HD）或者肾移植，其中肾移植是最适用的治 疗策略。

肾移植之后需要给病人注射免疫抑 制剂（ISs），以防止患者对移植物的排斥，但如果注射过量的ISs也可能导致机体免疫力下降从而引发机会感染等，因而ISs的量需要随时监控并作出调整，以使患者处于一种免疫平衡（免疫反应不会高到排斥移植物，也不会低到容易被病毒或细菌感染）的状态。

这种免疫平衡的状态具体是一种什么样的状态，暂时还鲜有文献能描绘清晰，因而明英姿老师课题组致力于准确描绘这种免疫平衡状态。

课题组首先描绘了T细胞的免疫状态，主要是考虑到T细胞在介导免疫排斥和病毒或细菌免疫中起到至关重要的作用，因而T细胞的免疫状态是一个很重要的方面，对于后续免疫平衡状态的标准制定也可能有一定的指导意义。

研究方法：

本研究首先选择了2012-2016年间接受肾移植的103名ESRD患者，其中满足入组条件的88人，将其分成了2组，其中47人为肾移植后1年以内，另外41人为肾移植5年后的患者，为评价其水平，同时纳入了41名参与健康体检的健康人。

为详细描绘T细胞的免疫分型及功能状态，本文使用了15种流式抗体，分成2个染色panel，详细信息如下：

两个panel分别为贝克曼公司推出的Duraclone IM全套抗体组合方案中的IM T cell Subset管和IM TCRs管。该产品的优点是干粉，保存的时间比液体更久；而且预混抗体也能节省实验时间，相比于自己混匀抗体后分装染色，样本间的一致性会更高。产品质量满足ISO 9001认证标准（ISO 9001-2008）。

所有样本染色好后使用贝克曼库尔特的13色流式分析仪分析。

研究结果：

文章所使用的圈门策略如下图所示：

文章仅仅使用2个染色panel（15种抗体）就实现了非常多T细胞亚群的检测，得到的信息非常多。

本文有条理地通过传统散点图圈门的方式将所有的流式结果很好地呈现出来了。

T细胞的亚群分群（CD3/CD4/CD8/ TCRαβ/ TCRγδ/Vδ1/Vδ2）以及活化状态HLA-DR、CD57和PD1的分群结果由于篇幅限制并未在这里展示，只展示了通常分群效果可能会不好的记忆性分群流式图，我们可以看到分群效果非常好，基于此实验结果的实验结论的准确度应该是非常高。

得到的总体结论是，肾移植病人的T细胞占淋巴细胞的比例相比于正常对照更低，但不同治 疗时间的病人之间没有差异。其中T细胞中的αβT细胞的占比升高，而γδT细胞的占比降低，由此可以猜测病人体内T细胞占淋巴细胞比例降低可能是由于γδT的数量减少导致的。而后续发现γδT细胞中的Vδ1比例升高但是Vδ2比例下降，进一步可以推测为γδT细胞的降低导致了T细胞比例降低。但是由于文章并未使用绝 对计数微球做绝 对计数，因而此猜想也无法验证，文章中展示的三分类计数结果只能简单做此猜想的验证。

至于T细胞的活化及老化状态，主要通过HLA-DR、CD57和PD1三个指标进行评价，发现仅有CD4+T和CD8+T细胞的PD1在病人中显著高于健康人，且不同治 疗时间的病人之间没有差异。但是CD57的表达仅在治疗早期病人的CD4+T细胞中显著高于健康人和长时间治疗的病人。提示病人体内的T细胞识别到外源移植物后受到ISs的影响不能很好地活化，但是细胞已经开始高表达耗竭信号PD1。

此外，CD4+T和CD8+T细胞的分化发育状态相关的指标（可用于做拟时序分析的指标CD27、CD28、CCR7、CD45RA）中，CD27和CD28在病人的T细胞上表达更低，CD4+T细胞上CCR7也是表达更低，并且CD8+T细胞的CD45RA表达更高，说明T细胞虽然能接收到来自移植物的抗原信息，即第 一信号，但是在ISs的影响下并不能增加第二信号的共刺激指标的表达。如果拟时序分析也能和绛维分析一样从单细胞测序分析中借鉴到流式分析中来，这部分结果的展示也可能会更直观一些。

综合以上结论，我们可以知道，淋巴细胞中T细胞比例降低，T细胞中γδT细胞比例降低，γδT细胞中Vδ2细胞比例降低，由于没有绝 对计数信息，只能推断为Vδ2细胞对于ISs更敏感，更容易在ISs的影响下比例降低，从而影响T细胞的亚群分布。此外，由于免疫抑 制剂的影响，虽然CD4+T和CD8+T细胞能接收到来自移植物的第 一信号，但是并不能提到第二信号（CD27和CD28）指标的表达，因而细胞并没有处于比正常人高的活化水平（HLA-DR和CD57），反而耗竭指标PD1更高，而且CD8的CD45RA的表达更高（Fig6中CM和EM均降低，即CD45RA-细胞降低）也说明了此结论；同时TEM/TCM的比例也更低，即功能性的效应记忆T细胞更少，而中 央记忆T细胞更多。

研究意义：

通过以上研究结果，我们知道了在ISs的影响下病人体内T细胞的亚群分布以及功能状态的变化，如果能进一步找到合适的免疫指标比例的Cutoff值，可能对于病人的免疫稳态的判断能够更准确。此外，找到与健康人的差异后，对于病人疾病状态的诊断也有着重大的意义。

 ● 文章来源： 

Zhuang Q, Peng B, Wei W, Gong H, Yu M, Yang M, Liu L, Ming Y. 2019. The detailed distribution of T cell subpopulations in immune-stable renal allograft recipients: a single center study. PeerJ 7:e6417 DOI 10.7717/peerj.6417.

 ● ESRD疾病参考数据来源： 

National Institutions of Health. (2018). United States renal data system. 2018 Annual data report: Epidemiology of kidney disease in the United States. Retrieved from https://www.niddk.nih.gov/.

Couser, W. G., Remuzzi, G., Mendis, S., & Tonelli, M. (2011). The contribution of chronic kidney disease to the global burden of major noncommunicable diseases. Kidney Int, 80(12), . Epub 2011 Oct 12. 1258–1270.

University of California San Francisco. (2020). The kidney project. Retrieved from https://pharm.ucsf.edu/kidney/need/statistics.