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- 【导读】 器材与试剂干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素.纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等具体步骤1.水:细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的...
器材与试剂
干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素.纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等
具体步骤
1.水:
细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.
2.PBS(也可用于其它BSS,如:Hanks,D-hanks液的配制):
主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗
溶解定容:将药品(NaCl8.0g,KCl0.2g,Na2HPO4?H2O1.56g,KH2PO40.2g)倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。用HCl或NaOH调PH到7.4。
移入溶液瓶内待消毒:将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
3. 胰蛋白酶溶液:
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在pH为8.0、温度为37℃时,胰酶溶液的作用能力Z强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶YZ剂终止胰酶对细胞的作用。
称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为0.25%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀,置于4℃内。
用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤CJ。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
4.0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液
称取胰蛋白酶粉末(1:250)0.05g,EDTA0.02g,加入PBSA100ml,0.22um微孔滤膜过滤CJ,分装,于-20℃保存。
5.青、链霉素溶液:
所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。分装于-20℃保存。使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度Z终为100单位/ml。
6.RPMI1640:
溶解、调PH值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml,使青链霉素的浓度Z终各为100单位/ml。然后用二氧化碳或碳酸氢钠调PH到7.2左右。Z后定容至1000ml,摇匀。
安装蔡式滤器:安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤CJ。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。
使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃时两周有效)。
7.血清的灭活:
细胞培养常用的是小牛血清,新买来的血清要在56℃水浴中灭活30分钟后,再经过抽滤方可加入培养基中使用。
8.HEPES溶液:
HEPES的化学全称位(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanicacid)。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L,一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。
1mol/LHEPE缓冲液配制方法如下:
准确称取HEPTS238.3g,加入新鲜三蒸水定容至1L。0.22um微孔滤膜过滤CJ,分装后4℃保存。
注意:因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶,所以可根据实际情况灵活配制,但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20mmol/L。如:称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中,过滤CJ后可完全(20ml)加入1L培养液中,或者每100ml培养液中加入2ml即可。
9.谷氨酰胺:
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4℃下放置1周可分解50%,故应单独配制,置于-20℃冰箱中保存,用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺。
一般培养液中谷氨酰胺的含量为1~4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液。配制方法为,谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,充分搅拌溶解后,过滤CJ,分装小瓶,-20℃保存,使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。
10.肝素溶液的配制:
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培养液中Z终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠,包装为约为0.56克/瓶,配制时,可将其溶于100ml三蒸水中,定容,然后过滤CJ,分装小瓶,保存温度为??℃。使用时,向100ml培养液中加入1ml(精确可加入0.9ml)即可。
11.Ⅰ型胶原酶:
0.1%Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意:因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤CJ。分装入10ml小瓶-20℃保存。
12.明胶溶液:
因为明胶难于过滤,所以配制0.1%明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克(配成100ml溶液)—即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液,明胶也难溶,因此要充分摇匀,放置,然后无菌操作分装入50ml小瓶中,4℃保存。
13.Hanks液:
称取KH2PO40.06g,Nacl8.0g,NaHCO30.35g,KCl0.4g,葡萄糖1.0g,Na2HPO4.H2O0.06g,加H2O至1000ml
注:Hanks液可以高压灭菌。分装于4℃下保存。
14.D-hanks液:
1液:NaCL:8.00g/L,KCL:0.04g/L,Na2HPO4.2H2O:0.06g/L,KH2PO4:0.06g/L,配500毫升;
2液:NaHCO3:0.35g/L,配100毫升;
3液:酚红:0.02g,用数滴NaHCO3溶解酚红
将2,3液移入1液中。定容到1000毫升PH值是7.4左右。分装于4℃下保存。
15.Giemsa染液:
称Giemsa粉末0.5克,加几滴甘油研磨,再加入甘油(使加入的甘油总量为33ml)。56℃中保温90~120分钟。加入33ml甲醇,置棕色瓶中保存,此为Giemsa原液。使用时按要求用PBS稀释。一般稀释10倍。
- 2004-07-16 10:28:52
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