新型原代细胞转染试剂

人们尝试过很多方法将质粒DNA导入细胞，常用的有DEAE右旋糖苷，磷酸钙沉淀，脂质体，显微注射和电击等物理方法。现有的转染技术都或多或少的有各种不足，其中转染效率低，细胞毒性高是研究者Z常遇到的困扰；而许多细胞系，特别是原代细胞是很难获得理想的转染效果的。现有的转染试剂产品在应用中还有一个普遍的问题，就是不太可能采用单一一种试剂在各种细胞上都获得较高转染效率；因此研究者不得不尝试很多种类的转染试剂而获得特定细胞的Z佳转染效果。如果某种转染试剂盒可以在各种细胞包括哪些“抗拒转染”的细胞的转染实验中都能获得好结果，对于广大研究者来说将是一个福音。

为了达到研究者的这种期望，默克Novagen经验丰富的研究团队开发了NanoJuice转染试剂盒，其两种组分互相促进，可以提高各种哺乳动物细胞的转染效果。采用Zxin的纳米科学技术Priostardendrimers（树枝状聚合物）和多价阳离子脂质体的特别设计，NanoJuice转染试剂混合物可以确保获得zhuo越的转染效率而细胞毒性极低。这种新的转染方法会帮助研究者在原代细胞和那些“顽固抵抗转染”的细胞上轻易获得成功。NanoJuice试剂盒中的两种试剂经过调节配比，很方便为不同的细胞设定Z佳转染效果的使用方法。有了NanoJuice转染试剂盒就再也不需要不断地为每一种细胞从头摸索不同转染方法或尝试各种产品了。我们建议您采用预试验为特定的细胞找到Z佳试剂用量，通常这个小试可以在24孔板中进行；一旦Zyou化的转染试剂用量确定了，后续的操作可以在此基础上非常方便地用等比缩放来轻松获得稳定的GX转染。

确定Z佳转染条件预实验

我们在一些原代细胞和其它较难转染的细胞上做了预试验，以便摸索试剂的Z佳用量和配比。每个试验设定6种条件，包括每ugDNA采用2种不同用量的NanoJuice核心转染试剂和4种不同用量的转染增强试剂（图1）。通常，NanoJuice的Z适使用量范围是：核心转染试剂1-2ul/ugDNA，转染增强试剂1-4ul/ugDNA。预试验结果显示，每种细胞的Z佳转染效果采用的两种转染试剂成分的比例可能差别甚大（图2）。我们的尝试表明每一种细胞均需设置预试验以获得Zyou化的实验条件，同时这些数据也证明了NanoJuice转染试剂盒是一种多功能转染工具，可以作为各种细胞GX转染的shou选。不断在各种细胞上尝试NanoJuice转染试剂盒发现其两种试剂成分的用量可以根据不同细胞的实际情况有更大幅度的调整。例如：Caco-2细胞的预试验中，NanoJuice核心转染试剂和转染增强试剂都是1ul/ugDNA。而进一步的尝试发现两种试剂的用量可以更低一些，分别为1ul和0.75ul，而转染效率有小幅提高（图3）。

图1确定Z佳转染条件的预实验，尝试8种转染核心试剂与转染增强试剂的不同配比，每种做3个重复。

图2预实验
转染前18-24h在24孔板接种细胞，转染时细胞融合度为60-90%。每3个重复的孔需准备：核心转染试剂0.9-1.8ul，转染增强试剂0.93.6ul，在70ul无血清培养基中稀释，室温孵育5min。图中标明每ugDNA所采用的NanoJuice核心转染试剂和转染增强试剂的不同用量（ul）。转染采用克隆了Renilla荧光素酶报告基因的pTriEx-5重组子，每孔DNA用量为0.9ug。质粒上带有CMV启动子，N端StrepTagII标签，Rluc报告基因和C端HisTag标签。转染混合物在室温下孵育15min。每孔加入转染混合物20ul。24-72h后，以100ulReportasol试剂抽提。10ul细胞抽提液中Rluc的活性采用试剂盒MightyLight分析。统计每孔相对光单位（RLU/well），3个重复取平均值。

图3进一步优化实验
转染前18-24h在24孔板接种细胞，转染时细胞融合度为60-90%。每3个重复的孔需准备：核心转染试剂0.68-0.9ul，转染增强试剂0.450.9ul，在70ul无血清培养基中稀释，室温孵育5min。图中标明每ugDNA所采用的NanoJuice核心转染试剂和转染增强试剂的不同用量（ul）。用于转染的报告重组子同图2实验，每孔DNA用量为0.9ug。转染混合物在室温下孵育15min。每孔加入转染混合物20ul。48h后，以100ulReportasol试剂抽提。10ul细胞抽提液中Rluc的活性采用试剂盒MightyLight分析。统计每孔相对光单位（RLU/孔），3个重复取平均值。

zhuo越的转染效果

分别确定了NanoJuice试剂的Z佳用量和配比后，我们尝试在后续实验中，分别转染了Saos-2，Caco-2，Raw264.7，Jurkat和动脉平滑肌细胞。同时以市售的其它转染试剂做对照（按厂家提供的产品说明书操作），实验结果（图4）显示，由优化的NanoJuice混合试剂转染的细胞表达Renilla荧光素酶的产量明显高于其它转染方法。另外，我们也比较了NanoJuice与GeneJuice转染试剂对于Caco-2，Raw264.7和Saos-2细胞系的转染效果（图5）。对于那些转染较为困难的细胞系，NanoJuice转染试剂盒获得的Renilla荧光素酶表达产量均高于GeneJuice转染试剂。

图4NanoJuice与其它转染试剂的比较
转染前18-24h在24孔板接种细胞，转染时细胞融合度为60-90%。转染操作按厂家说明书进行。用于转染的报告重组子同图2实验，NanoJuice转染试剂采用图2实验中确认的每种细胞的相应Z佳用量。（图中显示每ugDNA所用的两种NanoJuice试剂用量ul）2448h后,以100ulReportasol试剂抽提。10ul细胞抽提液中Rluc的活性采用试剂盒MightyLight分析。统计每孔相对光单位（RLU/孔），3个重复取平均值。

图5NanoJuice与GeneJuice转染“困难”细胞的结果比较
两种来自Novagen的DNA转染试剂用于转染Caco-2，Raw264.7和Saos-2细胞。转染前18-24h在24孔板接种细胞，转染时细胞融合度约为80%。按图2和4的条件转染。两种NanoJuice试剂的用量采用图2实验的Z佳用量。3个重复取平均值。

细胞毒性讨论

成功转染的另一个关键是细胞毒性低。细胞受损的表现包括形态上变圆或细胞不再贴壁等。转染48小时后拍摄的照片中Saos-2细胞非常健康，在同类产品中细胞毒性Zdi（图6）。

图6毒性比较
NanoJuice转染，其它转染试剂转染和无转染阴性对照的细胞毒性比较。采用Saos-2细胞转染，每实验3个重复。转染48h后拍照。
左上：阴性对照；右下：NanoJuice转染；
下图为两种常见市售转染试剂的细胞毒性实验。

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