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- 【导读】ELISA检测的干扰因素与方法ELISA应用最广,但这种固相测定技术非完美无缺,把握实验过程中每一个可能出现差错的关键性问题,采取相应的举措,才有可能使实验性误(漏)诊减少到最低限...
ELISA检测的干扰因素与方法
ELISA应用Z广,但这种固相测定技术非wan美无缺,把握实验过程中每一个可能出现差错的关键性问题,采取相应的举措,才有可能使实验性误(漏)诊减少到Zdi限度。1.表面效应首先必须明确指出的是,:“固相”ELISA与传统的“液相”血清学试验的Zda.Z本质的区别是有一个预先固相抗原或抗体到载体表面的步骤,以及抗原与抗体结合反应由液态环境移到了固相载体表面进行。蛋白质分子在吸附过程中,为了克服与固相载体之间的排斥力,需要重新分布其表面的功能性基因,使疏水性基因充分暴露,然后,局部接触区域的偶极分子脱氢,再通过范德瓦尔斯力吸引而固相到载体表面。表面效应可直接影响抗原,抗体的构象和功能。此外,表面效应亦影响抗原和抗体结合反应的动力学过程。(1)固相导致抗原的变化为了测定抗体水平,需预先将抗原固相(包被)到极性和水性的聚苯乙烯(PS)或聚氯乙烯(PVC)酶标板上。用直接物理吸附方法固相蛋白抗原及DNA等,导致的变化是多方面的,可引起分子构象和抗原性发生改变。酶活性测定时可消失。牛血清白蛋白固相之后,其抗原价可由5价降为1价。此外,发现被动吸附方法固相铁蛋白,呈团串状,不均一的随机分布,这种影响质控的情况具有普遍性。Z后,大多数小分子半抗原不易直接吸附到载体表面。解决这一难题的方法,一般是采用在小分子抗原上,先偶联上葡聚糖,明胶等手臂后再进行固相包被。对于有多重表达抗原决定簇的大分子抗原,用抗体桥式包被法可避免表面效应的影响。将蛋白抗原吸附于胶体AI(OH)3后再固相也可以避免蛋白变性。用Y射线辐照(400GY)PS板,不但可增加蛋白抗原吸附能力,而且还有降低抗体测定本底的作用。(2)固相对抗体的影响直接吸附固相抗体(Igs)分子,除了呈团串状,不均分布和易解吸等一般不利因素之外,Igs分子摊开在载体表面,不但构象发生改变,而且影响抗体的活性,如IgG的结合价减少,可由2价变为1价,甚至完全失活。实验结果表明,单克隆抗体比多克隆抗体更易失活,固相后仍能保持结合能力的分子仅占少数,分别为3%和5%-10%。这不但浪费抗体试剂,更可惜的是空置了有限的微孔表面积。抗体分子N末端为Fab,C末端为Fc,直接被动吸附的随意性,造成一部分Fab,C末端为Fc,直接被动吸附的随意性,造成一部分Fab结合位点朝向载体一面,或因用量过多而造成的重叠吸附,部分Fab结合位被遮盖,均可导致其总体结合能力下降。为此,出现了可以“锚定”F.段在载体表面,而使Fab朝外的共价结合法,即在载体上导入氨基肼基等活性基因,然后在水溶性碳二胺作用下,与Igs的羧基共价结合,或直接与羟基化糖基产生的醛基共价结合:含溴乙烯基团的PS板,可在双功能交联剂如戊二醛的帮助下与蛋白质共价结合。目前,国外已有有关的酶标板产品(ZL)供应。桥式法是一种避免Igs与载体直接接触的固相方法,有几种不同的类型:(1)抗抗体法:(2)SPA法:(3)链酶亲和素生物素法,这一种方法应用Z为成功,只要预先将diyi捕捉抗体生物素化:(4)抗半抗原抗体法,这需要将捕捉体预先记半抗原。(3)抗体介导的抗原分子变构抗原与抗体分子在三维立体空间自由运动,互相碰撞,彼此特异性结合,这种结合不似早期相像中的单纯的“锁-匙”关系,而是一种柔性的诱导契合。抗原分子决定簇可以突入到Fab的深底部,反过来,Fab为了执行其固有生物学功能,主动地发生变角折弯,锥形转动及ZN末端可变区的“球穴”摆动,以契合抗原决定簇,Fab亦可突入到大分子抗原的较深的位区。液态中的抗原体分子在完成一级结合反应之后,该复合物可以通过抗原抗体之间的特异性结合,亦可通过抗体Fc-Fc段的非特异性结合而进一步交联,形成肉眼可见的晶格形网络沉淀凝集型的抗原抗体二级反应复合物。纵观全过程,抗原分子一般总能保持其固有的构象,而复合物中的抗体构象变化则较大。相反,在固相抗体测定抗原的过程中,由于表面效应的关系,抗体介导的抗原分子变构具有特殊意义。2.HD-HOOK效应这种发生在固相法试验过程中的可造成“假低值”甚至“假阴性”错误结果的特殊效应,称为“高剂量钩镰(HD-HOOK)效应”。它的产生条件、分子基础、导致的后果等,都与传统的液相沉淀、凝集反应中的“区带现象”不一样。在一步二位点夹心ELISA中,主要是因为待测抗原的总量过高,竞争结合反应系统中的限量标记二抗,从而产生抗原越多,Z终反应信号越低的HD-HOOK效应,如HBsAg等可出现假阴性。抗原“量”是决定的因素,一般认为二步二位点夹心固相测定法不会产生抗原过剩的“阴滞现象”之观点,早已被Miles的实践否定,只是并非所有二步夹心法都会产生HD-HOOK效应。迄今为止,仅少数具有多重抗原决定簇的大分子蛋白质抗原,如铁蛋白、前列腺特异抗原(PSA)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、甲胎蛋白(Afp)、细胞溶素-D等,本身具有分子变构内因的抗原,测定时发现了HD-HOOK效应。抗原“质”的特性是决定的因素,而标记二抗介导抗原分子变构是重要的外因。当然抗原的数量亦是必备的相关因素。以铁蛋白为例,被捕捉的铁蛋白抗原分子,与亲和性比一抗大的标记二抗发生交叉重叠结合后,由于立体效应,可促使铁蛋白分子变构,使其与一抗解离,形成标记二抗与铁蛋白分子复合物,而被随后的洗涤过程洗离出去,Z终的信号下降。在剂量反应曲线的高剂量(HD)区段,其线型走向不是呈平台状无限后延,而呈向下弯落状,似一只钩或一把镰刀(HOOK).若单纯从剂量反应曲线的钩状图形来看,与区带现象中抗原过剩型复合物的“后带现象”十分相似。然而,其分子基础完全不同,“晶格理论”仅能解释区带现象,而对固相二步夹心ELISA的HD-HOOK效应的解释,目前认为,“抗原分子变构理论”比较贴切。克服HD-HOOK效应,主要依靠试剂盒的生产厂家。首先,对靶抗原的决定簇应尽可能弄清楚,在此基础上,选择仅有一种而且仅有两个重复表达的决定簇,或者两种且每种仅有一个表达的决定簇,选用相应的一个单抗,或者两个相应单抗来组建药盒,有可能从根本上解决HD-HOOK效应的弊端。作为应用者,可用稀释测定法解决这一问题。在测定未知标本的aFP值时候,用原标本与10倍稀释的标本同时测定,发现原倍孔A值低于稀释孔,证实了HD-HOOK的存在,从而避免了实验的误(漏)诊。网址:http:/www.fxbiocc.com仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。
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- 2004-11-09 09:23:09
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