流式分选实验技术服务|实验技术服务

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测序实验流程：
1作用原理：
对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有：蛋白酶类胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。
2注意事项：
①酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；②要注意酶的使用浓度和消化时间；③要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等；④要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。
实验方法
①将组织切成薄片，置入试管中；
②首先加入EDTA液5ml，室温下0.5h，离心弃之；
③再加入胰酶-EDTA液5ml。在37℃恒温水浴振荡器内30min；
④用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000prm，5min。再以生理盐水洗2-3次；
⑤细胞固定或低温保存备用。
血小板标记方法
全血法单标测血小板CD62p、CD63、CD42b、CD41、CD61等指标。
染色方法步骤：
（1）采血枸橼酸盐或EDTA抗凝；
（2）10μl荧光标记抗体，加100μlPBS，再加5μl全血（样品管）；
10μl抗体同型对照，加100μlPBS，再加5μl全血（对照管）；
轻轻混匀，室温孵育15min；
（3）加2-3mlPBS（1%PFA）终止反应，上机检测分析。
机械法分散实体组织包括：用手术剪刀剪碎或者用锋利的解剖刀剁碎组织，用匀浆器匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用300目尼龙网滤出单细胞悬液；采用搓网法也能获得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以机械法常与其它方法配合使用。
1剪碎法：
①将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水；
②用剪刀将组织剪至匀浆状；
③加入10ml生理盐水；
④用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中；
⑤离心沉淀1000prm,3-5min，再用生理盐水洗3遍，每次以低速（500-800prm）短时离心沉淀去除细胞碎片；
⑥以300目尼龙网滤去细胞团块；
⑦细胞用固定液固定或低温保存备用。
2网搓法
①将100目，300目尼龙网扎在小烧杯上；
②把剪碎的的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完；
③收集细胞悬液，离心沉淀500-800prm，2分钟；
④固定细胞或低温保存备用。
3研磨法
准备一只70ml研磨器。
①先将组织剪成1-2mm3大小组织块；
②放入组织研磨器中加入1-2ml生理盐水；
③转动研棒，研至匀浆；
④加入10ml生理盐水，冲洗研磨器；
⑤收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀500-800prm，1-2min，再以生理盐水洗3遍，离心沉淀；
⑥固定或低温保存细胞悬液，备用。

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