猪ANG-1酶联免疫分析ELISA试剂盒实验原理与注意事项

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中ANG-1水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入ANG-1、生物素化的抗ANG-1抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成Z终的黄色。颜色的深浅和样品中的ANG-1呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制

1.酶联板：一块（96孔）

2.标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为100ng/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成200ng/mL，100ng/mL，50ng/mL，25ng/mL，12.5ng/mL，6.2ng/mL，3.1ng/mL，其原液直接作为Zgao标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0ng/mL，临用前15分钟内配制。

如配制100ng/mL标准品：取0.5ml200ng/mL的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3.样品稀释液：120ml/瓶。

4.检测稀释液A：110ml/瓶。

5.检测稀释液B：110ml/瓶。

6.检测溶液A：1120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A1：100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

7.检测溶液B：1120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液B1：100稀释。稀释方法同检测溶液A。

8.底物溶液：110ml/瓶。

9.浓洗涤液：130ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10.终止液：110ml/瓶（2NH2SO4）。

标本的采集及保存

1．血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

2．血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8C1000xg离心15分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

各试剂在使用前平衡至室温。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，注意不要有气泡，轻轻混匀，酶标板加上盖，37℃反应120分钟。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。

3.每孔加检测溶液A工作液100ul，37℃,60分钟。洗板3次，350ul/每孔，甩干。

4.每孔加检测溶液B工作液100ul，37℃，60分钟，洗板5次，甩干。

5.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色30分钟（此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显）。

6.依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时兰色立转黄色）。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。

注：

1．每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是Z后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层

吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

特异性

本试剂盒可同时检测猪ANG-1，且与其它相关蛋白无交叉反应。

计算

以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

关键词：

仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。

相关热词：

等离子清洗机,反应釜,旋转蒸发仪,高精度温湿度计,露点仪,高效液相色谱仪价格,霉菌试验箱,跌落试验台,离子色谱仪价格,噪声计,高压灭菌器,集菌仪,接地电阻测试仪型号,柱温箱,旋涡混合仪,电热套,场强仪万能材料试验机价格,洗瓶机,匀浆机,耐候试验箱,熔融指数仪,透射电子显微镜。