酶联免疫elisa试剂盒吸附试验原理 1.辣根过氧化物酶（HRP） 2.碱性磷酸酶

酶联免疫elisa试剂盒吸附试验原理

酶联免疫一种酶联免疫技术。用于检测包被于固相板孔中的待测抗原（或抗体）。即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，Z后通过酶作用于底物后显色来判断结果。

酶联免疫吸附试验（以下简称ELISA）：是酶免疫测定技术中应用Z广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。基本原理　　ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

　　用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用Z广。

　　过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量Zgao，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH3-9，催化反应的Z适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的Zda吸收光谱分别为275nm和403nm。

　　酶的纯度以RZ表示：RZ=OD403/OD275

　　纯酶的RZ多在3.0以上，Zgao为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占75%，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：⑴邻苯二胺（OPD），产物为橙色，可溶性，敏感性高，Zda吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中Z常用的一种；⑵联大茴香胺（OD），产物为橘黄色，Zda吸收值在400nm，颜色较稳定；⑶5－氨基水杨酸（5－AS）：产物为深棕色，Zda吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；⑷邻联甲苯胺（OT）产物为蓝色，Zda吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，但反应快，颜色明显。

　　系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。它们的底物种类很多，常用者为硝基苯磷酸盐，廉价无毒性。酶解产物呈黄色，可溶，Zda吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反应系统中，37℃1分钟水解1μg磷酸苯二钠为一个单位。

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