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- 【导读】 真菌毒素概述 真菌毒素是农产品的主要污染物之一,人畜进食被其污染的粮油食品可导致急、慢性真菌毒素中毒症(myco—toxicc)ses)。我国是一个农业大国,小麦、玉米、大米及花
- 真菌毒素概述
真菌毒素是农产品的主要污染物之一,人畜进食被其污染的粮油食品可导致急、慢性真菌毒素中毒症(myco—toxicc)ses)。我国是一个农业大国,小麦、玉米、大米及花生等是居民的主要食品原料,每年因霉变而导致25000t粮食不能食用。出口粮食由于真菌毒素超过输入国限量标准而遭警告或降低等级的现象时有发生。某些食物中毒、慢性病及癌症的发生与摄入含有真菌毒素的食品有关。1985~1992年,我国河南、广西、河北、安徽和江苏等省的部分地区共发生由赤霉病麦或霉玉米导致的人畜脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxvnivalenol,DON)中毒15起。特别是在1991年春夏之交,我国部分省市遭受特大洪涝灾害,受灾严重的安徽、江苏、河南等省正值小麦收获季节,暴雨使小麦的收割、脱粒等操作无法进行,导致大量小麦发霉,仅安徽一省就有13万多人因食用霉变小麦而发生急性中毒,严重危害了人民的身体健康。
目前为止,全世界已经发现了300多种结构不同的真菌毒素,其中已经被分离鉴定的有20多种。Hesseltine就真菌毒素对农业及人类健康的危害程度和对社会经济发展影响的重要性,对世界上30多个国家和地区进行了调查,结果表明,排在**位的是黄曲霉毒素,其次为赭曲霉毒素A(ochratoxin A,0TA)、单端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)、橘青霉素(citrinin)、杂色曲霉素(sterigmatocystins,ST)、展青霉素(patulin,Pat)、圆弧偶氮酸(cycloplazonlc acid,CPA)等,该项调查进行之时伏马菌素(fumonisins,FMs)尚未被发现。调查还发现,被真菌毒素污染*严重的农产品是玉米、花生和小麦。因此,真菌及其毒素与人类健康的关系已引起全世界的广泛关注。
1.黄曲霉毒素
黄曲霉毒素(aflatoxin)主要是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物,黄曲霉毒素污染的发生和程度随地理和季节因素以及作物生长、收获、贮存的条件不同而异,粮油作物在收获后、贮藏期以及加工后都能受到产毒菌株污染,有时早在作物收获前就已受到了产毒菌株的污染。
1960年在英格兰南部和东部地区,十几万只火鸡因食用发霉的花生粉而中毒死亡。剖检中毒死鸡,发现肝脏出血、坏死,肾肿大,病理检查发现肝实质细胞退行性病变及胆管上皮细胞增生。研究发现火鸡饲料中的花生粉含有一种荧光物质,是导致火鸡死亡的病因,并证实了该物质是黄曲霉的代谢产物,故命名为黄曲霉毒素。
黄曲霉毒素于1993年被世界卫生组织(wHo)的癌症研究机构划定为一类致癌物。黄曲霉毒素有较多的种类,主要有B,、Bz、G1、G2、M1和M2。它们的结构式不同,其毒性及危害也有很大差异。黄曲霉毒素的衍生物中以黄曲霉毒素B?的毒性及致癌性*强,在食品中的污染*广泛,对食品的安全性影响*大。因此,在食品卫生监测中,主要以黄曲霉毒素B1为污染指标。黄曲霉毒素的毒性极强,但其毒性随着毒素的剂量、接触时问长短和动物种类、营养状态及饲料不同而异。在动物实验中,大剂量摄人这些毒素会造成死亡;亚致死剂量产生慢性中毒;长期接受低剂量则导致癌症,主要是肝癌。黄曲霉毒素进入机体后经细胞色素P450催化生成相应的活性衍生物而表现出毒性。一部分被酶降解;一部分与细胞蛋白质,类脂结合引起细胞死亡,表现为急性中毒;若与核酸(DNA)结合会导致突变、致癌。其急性中毒的毒性是***的10倍,是的68倍,幼年动物比同种老年动物更为敏感,不同种动物的敏感性也有差异,雏鸭*敏感。黄曲霉毒素B。对几种动物的LD50。
2.赭曲霉毒素
赭曲霉毒素*初是从南非的赭曲霉毒株中分离出来的,由赭曲霉(Asper-gillus ochraceus)、洋葱曲霉(Aspergillus alliaceus)、鲜绿青霉(Pencillium viridicatum)、徘徊青霉等代谢产生,包括7种结构类似的化合物,赭曲霉毒素A是其中毒性*强的物质,是自然界中的主要天然污染物。在一些国家的食品中,赭曲霉毒素A的污染率可达2%~30%。该化合物主要表现为肾脏毒性。在巴尔干地方性肾病流行区,6%~18%人群的血液中能检出赭曲霉毒素A。
国际癌症研究机构(IARC)(1993)认为赭曲霉毒素A是一种与人类健康密切相关的霉菌毒素,是人类可能的致癌剂。除了潜在的遗传毒性和致癌性外,赭曲霉毒素A也是一种具有免疫YZ、神经毒性以及致畸性的物质。
3.展青霉素
展青霉毒素(Pat),又叫棒曲霉毒素和珊瑚青霉毒素,主要是由棒曲霉(Aspergillus clavatus)、扩展青霉(Pencillium expansum)、展青霉(Pencillium patulium)、曲青霉(Pencillium aspergillus)等代谢产生的一种免疫YZ剂。
展青霉毒素是一种神经毒素,其能诱发实验动物肿瘤,并对消化系统和皮肤组织具有损害作用。研究发现,Pat对试验动物有较强的毒性,其对部分动物的LDS。Pat对鼠类的急性中毒主要表现为痉挛、肺出血水肿、皮下组织水肿、肾淤血变性、无尿直至死亡。1953年日本从引起奶牛中毒的发芽饲料中分离出了荨麻青霉,并从中检测出了Pat。中毒奶牛主要表现为上行性神经麻痹、神经系统水肿及灶性出血。亚急性毒性试验表明,高剂量的Pat对大鼠的肾及胃肠系统有毒性作用。
Pat还具有致畸性、致突变性和致癌性,可在皮下注射部位引起雄性大白鼠发生局部肉瘤,能导致植物和动物细胞的染色体有丝分裂受阻和双核细胞的形成,对鸡胚有明显的致畸作用,出壳后的小鸡主要表现外张爪、颅裂、啄畸形、突眼等。Pat遗传毒性较低,对Hela细胞、大鼠肺细胞的初级培养物具有细胞毒性作用,还能改变细胞膜的通透性,可YZ细胞中大分子物质合成,并能造成细胞中非蛋白质巯基耗竭,导致细胞活性丧失。
4.单端孢霉烯族化合物
单端孢霉烯族化合物是由头孢菌(ephalosporium)、镰孢菌(Fusarium)、葡萄状穗霉(Stachybotrys)和木霉菌(Trichodema)等代谢产生的一组生物活性和化学结构相似的有毒代谢产物。
单端孢霉烯族化合物可引起猪、狗、猫、鸭雏等动物急性中毒,对各种实验动物的LD5D。中毒动物主要症状有呕吐、衰弱、血性腹泻及运动失调等。肉眼可见肠道、淋巴结和心脏多发性出血点或出血斑,肠腔内含有大量的暗红色内容物。显微镜下可见肠道、淋巴结、心脏出血,胃肠道上皮细胞坏死,淋巴结、及肝脏细胞构成减少。
有些单端孢霉烯族化合物可影响动物的免疫系统而改变其免疫应答,导致迟发型变态反应以及抗感染能力降低。
5.玉米赤霉烯酮
玉米赤霉烯酮(ZEA)又名F一2毒素,是由镰刀菌属的菌种产生的代谢产物。*早是由染有赤霉病的玉米中分离得到的,是由禾谷镰孢(Fusarium gra-minearum)、黄色镰孢(Fusarium culuorum)、木贼镰孢(Fusarium eqlliseli)、半裸镰孢(Fusarium semi。tectum)、茄病镰孢(Fusarium solani)等菌种产生的。许多国家曾报道,猪和牛等家畜摄食被玉米赤霉烯酮污染的谷物或饲料后,可引起动物雌性激素中毒症。
玉米赤霉烯酮对动物急性毒性作用很小,该化合物在膳食中的浓度低时,具有生理活性而不呈现毒性作用。ZEA具有雌激素样作用,主要作用于生殖系统,母猪特别是小母猪对该毒素特别敏感。ZEA可引起青春期前的小母猪的**、子宫和**肿大以及卵巢萎缩,严重情况下导致**和直肠脱垂。
人和妊娠期的动物食用含玉米赤霉烯酮的食物可引起**和乳腺肿胀、流产、畸胎和死胎。食用含赤霉病麦面制作的食品也可引起神经系统的中毒症状,如恶心、发冷、头痛、精神抑郁、供济失调等。玉米赤霉烯酮引起猪的雌性激素过多在澳大利亚、加拿大、丹麦、英国、美国、法国、德国、日本等许多国家均有报道。
6.杂色曲霉素
杂色曲霉素(sT)主要是杂色曲霉(AsperNllus vel‘sicolor’)和构巢曲霉(Asper-gmus mdulans)的*终代谢产物,同时又是黄曲霉(Asper百llus:flavtIs)和寄生曲霉(Asperg1lus parasiticus)合成黄血霉毒素过程后期的中间产物。据报道,感染了杂色
曲霉的玉米在27℃的环境下,21天可产生杂色曲霉毒素12g/妇以上。
杂色曲霉素是一种毒性很强的肝及肾脏毒素,可引起动物肝和肾的坏死。人畜进食被sT污染的谷物可引起食欲减退、拒食、进行性消瘦、精神抑郁、虚弱、死亡等中毒症状,并有致畸、致突变和致癌作用。在肝癌病发区居民所食用的食物中,杂色曲霉素污染较为严重,提示该地区肝癌的发生可能与杂色曲霉素对食品的污染有某种关系。
杂色曲霉素能造成大鼠和猴子类似黄曲霉毒素B?的损伤,包括胆管增生,核多型性变,肾和肝的出血坏死。杂色曲霉素可导致大鼠的肝瘤和皮肤扁平细胞癌;诱发猴的肝肿瘤;反复多次静注杂色曲霉素可引起大鼠的肉瘤。
杂色曲霉素与人类健康的关系,尤其是与某些慢性病和癌症的关系越来越受到国内外学者的重视,搞清其致癌机理对阐明杂色曲霉素在人类肿瘤发病中的作用,更好地采取预防措施尤为重要。
7.伏马菌素
伏马菌素是一组由串珠镰孢(Fusarium moniliorme)、轮状镰孢(Fusarium verticIllioides)、多育镰孢(Fusarium proliferatum)和其他一些镰孢菌种产生的真菌毒素。
动物实验表明,伏马菌素主要损害肝脏功能,FB1可引起马脑部重度水肿,延髓髓质有早发的、两侧对称的斑点样坏死,脑白质软化样改变,称为马脑白质软化症(ELEM)。给马静脉注射FB1后,可出现明显的神经中毒症状,表现为精神紧张、淡漠、偏向一侧的蹒跚、震颤、供济失调、行动迟缓、下嘴唇和舌轻度瘫痪,不能进食等,继而出现强直性痉挛。FB1还可引起猪肺水肿症候群(PPE)、羊的肝病样改变和肾病,大鼠的肝坏死、心室内形成血栓等。
伏马菌素对人的危害研究正在国际问广泛进行,目前还未得到直接的证据。但是,伏马菌素在食品中的污染状况以及与人和动物疾病或肿瘤之间的关系已引起人们高度重视。
1、玉米赤霉烯酮的检测:一般都采取液相和气相色谱的方法进行测定。测定的方法较为复杂,对仪器的要求也很高,但结果很准确。还有的是从分子生物学的角度进行分析,测定的范围在5-100μg/mL。但目前也探索出一套可供实验室简易测定的方法。称取10g样品,先用10mL1mol/L的盐酸酸化,然后用100mL氯仿萃取30min(可放在振荡器上振荡),静置后过滤。取氯仿液20mL,用1mol/L氢氧化钠50mL进行反提取两次。将提取液浓缩至20mL左右,再用氯仿液50mL萃取两次。浓缩至2mL左右使用硅胶60板,用氯仿一丙酮(2:98或4:96)作为展开剂,在紫外灯下观察亮点。如出现蓝色荧光,即含有玉米赤霉烯酮。
2、呕吐毒素的检测方法有薄层色谱法(TLC)、GX液相色谱法(HPLC)、柱净化法结合电子捕获检测器的气相色谱法(GC/ECD)、GX液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)、放射性免疫测定法(RIA)等; Casale等则提出了酶联免疫(ELISA)检测方法。在ZG,魏润蕴等提出了采用甲醇-水提取,以XAD-4柱净化,双向展开的薄层色谱检测方法及气相色谱法;郭玉凤等提出了使用PIB-CI(氯化聚异丁烯)衍生化的液相色谱检测方法;阳传和等提出了酶联免疫吸附的测定方法;张鹏等提出了采用免疫亲和柱(IAC)或多功能净化柱(MFC)净化结合GX液相色谱法。
3、薄层色谱法(TLC)是GB/T5009.111-2003采取的谷物及其制品中呕吐毒素的检测方法,其检测限为1mg/kg。适用于谷物(小麦、玉米、大麦等)及其制品(蛋糕、饼干、面包等)和中呕吐毒素的测定。谷物及其制品中的呕吐毒素经乙腈-水(84:16 V/V)提取、净化、浓缩和硅胶G薄层展开后,加热薄层板。在制备薄层板时加入三氯化铝,使DON在波长365nm紫外光下显蓝色荧光,与标准比较。薄层色谱法TLC虽然操作简便,曾被广泛应用,但是,处理样品时工作量大;在检测过程中操作人员必须直接接触标准品,危害到操作人员的身体健康,而且本方法在提取过程中需要使用大量的有机溶剂,这样就会对周围环境也会产生不利影响;灵敏度差,提高灵敏度必须改进样品的提取和净化方法,改进和提高薄层色谱分析性能,这样就增加了劳动强度和检测成本。
DON经HPLC分离后可用荧光检测器(fluorescencedetector,FLD)、紫外检测器(ultravioletdetector,UV)、二极管阵列检测仪(diodearraydetector,DAD)检测。实验证明,DAD比FLD的效果好:不需衍生;DAD*低检出限比FLD要低;DAD检测比FLD响应强。2001年Mateo使用DAD的*低检出限可达5μg/kg,而FLD的*低检出限为25μg/kg。谷物中DON的HPLC-UV的*低检出限可达100~1600μg/kg;HPLC-MS可达1240μg/kg;HPLC-FLD可达20μg/kg。运用气相色谱检测DON需要通过DON上的三个羟基使之衍生成为七氟丁酰(heptafluorobutyryl,HFB)、三氟乙酰(trifluoroacetyl,TFA) 或三甲基硅烷(trimethylsilyl,TMS) 化衍生物。
GX液相色谱法(HPLC)和气相色谱(GC)可以精确地对样品中的呕吐毒素进行定性定量分析。测定DON需进行衍生化,通过三甲硅烷衍生物,利用电子捕获检测器进行定量分析,操作繁琐、重现性较差。而且这两种方法所需色谱仪、检测器等价格昂贵,而且样品前处理比较复杂,操作时需要专门的技术人员,不便推广应用。另外,它们也不适合大批量样品的检测。
4、酶联免疫吸附测定法
免疫酶技术(EIA)根据抗原抗体反应后是否需要分离��合的与游离的酶标记物而分为均相(homogenous)和异相(heterogenous)两种类型。在异相法中,又包括液相异相酶免疫测定和固相酶免疫测定二种。固相酶免疫测定也称为ELISA,是临床检验中应用较广的免疫测定方法。小分子的ELISA测定法一般有三种竞争分析模式:包被特异性抗体直接竞争法、包被抗原直接竞争法以及间接竞争法(也称为YZ性测定法)。间接竞争ELISA法的基本步骤是:包被完全抗原——同时加入已知抗体和待测抗原——加入酶标二抗——加入底物显色液。该法主要应用于未知抗原的检测。
酶联免疫吸附法(ELISA)快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备,且对样品纯度要求不高,特异性强,特别适用于大批量样品的检测,发展非常迅速。简化了样品预处理和纯化过程。但是由于免疫酶的活性非常不稳定,在应用过程中很容易受到操作条件的影响,反应试剂需低温保存。在实际操作过程中很难达到这一要求,使得免疫酶的活性大大降低,从而影响到结果的准确性。应用时还必须通过多次洗涤,才能使反应产物和游离底物进行分离,影响到结果的重复性,而且检测时间较长,无法满足现场快速检测的要求。
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- 2006-08-15 10:21:42
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