细胞计数及活力的测定操作步骤

一。原则

在正常条件下，培养的细胞需要一定的密度才能生长良好，因此需要进行细胞计数。计数结果以每毫升的细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

总是有一些细胞由于各种原因而死亡。活细胞在总细胞中的百分比称为细胞生存力。通常需要检查从组织分离的细胞的活力，以了解分离过程对细胞的影响。是否有损坏。还应检查回收细胞的活力，以了解冷冻和复苏的作用。

使用台盼蓝对细胞染色，将死细胞染色，不将活细胞染色，因此您可以将死细胞与活细胞区分开。使用细胞中的某些酶与特定试剂反应也可以确定细胞的相对数量和相对活力。

2.仪器，用品和试剂

1.仪器和耗材：普通显微镜，血细胞计数器，试管，移液管，酶标仪（或分光光度计）

2.试剂：0.4％的锥虫蓝，0.5％的四甲基偶氮盐（MTT），酸化的异丙醇

3.材料：细胞悬液

3.操作步骤

（一）细胞数

1.擦拭干净血细胞计数器板和盖玻片，然后盖上计数板的盖玻片。

2.吸出少量细胞悬液，将其滴到盖玻片的边缘以填充盖玻片和计数板之间的空间。

3，静置3分钟。

4.在显微镜下观察并计数计数板四个大网格中的细胞总数。仅计算左侧和上方的单元格。然后计算如下：

细胞数/ ml = 4个大细胞总数/ 4×10000

注意：在显微镜下偶尔会看到由两个以上细胞组成的细胞簇，应将其计算为单个细胞。如果细胞簇占10％以上，则说明分散性不好，需要再次制备细胞悬液。

（2）细胞活力

1.在试管中加入0.5ml细胞悬液。

<2>加入0.5ml 0.4％锥虫蓝染料溶液，染色2-3分钟。

3.用移液器将一点悬浮液吸到载玻片上，并添加盖玻片。

4.在显微镜下取几个视野，计算死细胞和活细胞的数量，并计算细胞活力。

死细胞可以用锥虫蓝染色，在显微镜下可以看到深蓝色细胞，活细胞没有被染色，在显微镜下看起来是无色透明的。

可以与细胞计数一起进行活力测定，但应考虑染料溶液对原始细胞悬液的双重稀释作用。

（3）MTT法测量相对细胞数和相对生存力

活细胞中的琥珀酸脱氢酶可以分解MTT，产生蓝色结晶的for石颗粒，这些颗粒在细胞内和细胞周围积累。数量与细胞数量成正比，也与细胞活力成正比。

将细胞悬液以1000 rpm离心10分钟，弃去上清液。

2。向沉淀物中加入0.5-1ml MTT，用移液管吸取以形成悬浮液。

3，在37°C孵育2小时。

4。加入4-5毫升酸化的异丙醇（恒定体积）。打得好。

5，以1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调至零位。

注意：MTT方法只能测量细胞的相对数量和相对活力，而不能测量细胞数量**。

附：1、0.4％台盼蓝染料溶液制备：

blue台盼蓝0.4g，加双蒸馏水至100 ml。

2，MTT准备：

0.5 g MTT，溶于100 ml磷酸盐缓冲液或无酚红的碱溶液中。储存在4℃。

3.酸化异丙醇的制备：

在异丙醇中加入HCl，使ZZ的* 0.04mol / L。

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信息来源：生物技术网络信息ZX