- 功能性肠道芯片的 4D 实时成像和计算模型评估蠕动如何促进肠道病原体入侵
- 举办高低温冷热试验箱技术研讨会,皓天推动行业发展
- 中科院上海光机所李青会课题组:科技解锁建盏釉面千年奥秘 | 前沿用户报道
- 和瑞家人“益”起健步走,好City啊!
- 喜报 Sciclone G3 NGSx 系列基因测序文库制备仪获批二类医疗器械注册证
- 学术会议邀请 | 山东省静脉输液治疗护理会议·潍坊
- 邀请函 | 第十四届亚太膜学会(AMS 14)
- 皓天新款高温烤箱干燥箱重磅发布,行业瞩目!
- 35℃低温喷雾干燥技术与有机溶剂喷雾干燥技术将在【第三届MAH大会】大放异彩
- 如何确定尘埃粒子计数器的采样点位?
- 实验室纯水机RO反渗透膜应该如何选择?
- 揭秘高低温试验箱的低能耗运行策略
- 恒温恒湿试验箱:压缩机的核心技术
- 来源:内容来源于网络 浏览量:688次
- 【导读】 测序引物设计指南-混匀仪技术文章测序引物设计指南-混匀仪技术文章 本帖*后由 towersimper 于 2012-10-25 09:
- 测序引物设计指南-混匀仪技术文章
测序引物设计指南-混匀仪技术文章本帖*后由 towersimper 于 2012-10-25 09:52 编辑
测序引物设计指南
PCR引物设计方法:
1.引物*好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度(primerlength)常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间,Tm值*好接近72℃。
GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(meltingtemperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值*好接近72℃以使复性条件*佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A,*好选择T。
引物3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低,G和C错配的引发效率介于A、T之间,所以3′端*好选择T。
6.碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发(Falsepriming)。降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布*好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer与Crossdimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话,应尽量使其△G值不要过高(应小于4.5kcal/mol)。否则易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8.引物5′ 端和中间△G值应该相对较高,而3′ 端△G值较低。
△G值是指DNA双链形成所需的自由能,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,△G值越大,则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高,而3′端△G值较低(**值不超过9)的引物。引物3′端的△G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。(不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析)
9.引物的5′ 端可以修饰,而3′ 端不可修饰。
引物的5′端决定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入点突变、插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等。
引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。
10.扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响,选择扩增片段时*好避开二级结构区域。用有关软件(比如RNAstructure)可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板。实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
11.引物应具有特异性。
引物设计完成以后,应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性,就可以进行下一步的实验了。
值得一提的是,各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难,例如GC含量偏高或偏低,导致找不到各种指标都十分合适的引物;用作克隆目的的PCR,因为产物序列相对固定,引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次,尽量去满足条件。
做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。
♦总结:
1)避免重复碱基,尤其是G.
2)Tm=58-60度。
3)GC=30-80%.
4)3端*后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
5)正向引物与探针离得越近越好,但不能重叠。
6)PCR扩增产物长度:引物的产物大小不要太大,一般在80-250bp之间都可;80~150bp*为合适(可以延长至300bp)。
7)引物的退火温度要高,一般要在60度以上;
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力,即引物应该跨外显子,*好是引物能跨外显子的接头区,这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件,PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。
做染料法*关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物,你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。
关于BLAST的作用应该是通过比对,发现你所设计的这个引物,在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中,除了和你的目标基因之外,还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列,如和你的目标序列之外的序列相同的序列,则可能扩出其他序列的产物,那么这个引物的特异性就很差,从而不能用。
仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。
相关热词:
金相分析仪,油品分析仪,针焰试验仪,液位传感器,土壤测试仪,高效液相色谱仪价格,霉菌试验箱,跌落试验台,离子色谱仪价格,噪声计,集菌仪,接地电阻测试仪型号,柱温箱,旋涡混合仪,电热套,场强仪万能材料试验机价格,洗瓶机,匀浆机,耐候试验箱,熔融指数仪,透射电子显微镜。
- 2007-04-29 13:19:15
- 标签:
- 收藏(0) 赞(0) 踩(0)
- 随时了解更多仪器资讯,求购、招标、中标信息实时更新,厂商招商信息随时看。大量、齐全、专业的仪器信息尽在仪器网(yiqi.com)。扫一扫关注仪器网官方微信,随时随地查看仪器用户采购、招标需求!
-
HACCP体系在乳制品生产中的实施现状及有效应用研究-ATP荧光检测仪技术文2007-05-11 13:54:58
HACCP体系在乳制品生产中的实施现状及有效应用研究-ATP荧光检测仪技术文章HACCP
-
调味品中苏丹红的风险评估及其风险管理措施研究-ATP荧光检测仪技术文章2007-06-01 13:10:42
调味品中苏丹红的风险评估及其风险管理措施研究-ATP荧光检测仪技术文章调味品中苏丹红的风
-
番茄酱生产企业HACCP体系建立研究及存在的问题浅析-ATP荧光检测仪技术文2007-06-03 11:13:28
番茄酱生产企业HACCP体系建立研究及存在的问题浅析-ATP荧光检测仪技术文章番茄酱生产
-
天津地区中小出口食品企业HACCP应用现状及对策探讨-ATP荧光检测仪技术文2007-06-11 12:22:21
天津地区中小出口食品企业HACCP应用现状及对策探讨-ATP荧光检测仪技术文章天津地区中
-
原装BURKERT角座阀2000系列技术文章2004-07-19 09:04:10
原装BURKERT角座阀2000系列技术文章欢迎光临东莞市科比特公司,今天给大家介绍的是BURKE
-
威格士VICKERS叶片泵专业技术文章2004-07-19 09:04:10
威格士VICKERS叶片泵专业技术文章VICKERS叶片泵均为卧式、单泵壳结构的离心泵。采用特殊的
-
德国赫斯曼交换机专业性技术文章2004-07-19 09:04:10
德国赫斯曼交换机专业性技术文章赫斯曼交换机的全双工是指赫斯曼交换机在发送数据的同时也能够接收数据,
-
德国GSR高压电磁阀实用技术文章2004-07-19 09:04:10
德国GSR高压电磁阀实用技术文章GSR高压电磁阀是用来控制流体的自动化基础元件,属于执行器;并不限
-
技术文章之GSR电磁阀维修技术2004-07-19 09:04:10
技术文章之GSR电磁阀维修技术德国GSR是防爆出名的,那么我们在使用GSR电磁阀的同时,也应该适当
-
关于热工宝典技术文章的 热工宝典2004-07-25 09:29:08
关于热工宝典技术文章的 关于热工宝典技术文章的 热工宝典 HR-2000热工宝典从事工业自动化控制行
测序引物设计指南-混匀仪技术文章
-
您可能感兴趣
①本文由仪器网入驻的作者或注册的会员撰写并发布,观点仅代表作者本人,不代表仪器网立场。若内容侵犯到您的合法权益,请及时告诉,我们立即通知作者,并马上删除。
②凡本网注明"来源:仪器网"的所有作品,版权均属于仪器网,转载时须经本网同意,并请注明仪器网(www.yiqi.com)。
③本网转载并注明来源的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品来源,并自负版权等法律责任。
④若本站内容侵犯到您的合法权益,请及时告诉,我们马上修改或删除。邮箱:hezou_yiqi