- 助力科研,浦江论剑—思想碰撞深度交流会
- 星与辰品牌创新实录,携手捷信达构建智慧酒店新业态
- 详解SR-CPMG序列、MSE-CPMG序列及其测试方法,更有全新升级纽迈核磁数据分析软件等你来看!
- 【用户会速递】大会报告(二):X射线荧光与嫦娥样品元素分析
- 国仪量子2024年中工作会议成功举行
- 安谱实验深度参与《上海农业科技成果路演——畜牧成果专场活动》,共同推动畜牧产业向高质量发展迈进!
- MP工具箱 | 云学堂:一键开启免费学习平台
- 【热点应用】Mastersizer3000激光粒度仪干法表征硫化固体电解质粒径大小及分布
- 再度聚首 展新风采丨 三思纵横再亮相中国国际储能、锂电池及氢能技术展览会
- 恒温摇床常见故障及处理办法
- 恒温恒湿培养箱安全使用
- 真空冷冻干燥机用途科普:需要冻干操作的实验有哪些
- VICTOR 98A+/98C+智能万用表焕新升级
![上海长方光学仪器有限公司](http://yiqi-oss.oss-cn-hangzhou.aliyuncs.com/aliyun/Manage/2018-07-06/20180706-2055212137.jpg)
- 来源:内容来源于网络 浏览量:865次
- 【导读】 PCR常见问题2-混匀仪技术文章PCR常见问题2-混匀仪技术文章 克隆 PCR产物 1) 克隆 PCR产物的*优条件是什么? *佳插入片段:载体比需实验确定
- PCR常见问题2-混匀仪技术文章
PCR常见问题2-混匀仪技术文章
克隆 PCR产物
1) 克隆 PCR产物的*优条件是什么?
*佳插入片段:载体比需实验确定。1:1(插入片段:载体)常为*佳比,摩尔数比1:8或8:1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶,插入片段共10ul。室温保温1小时,或4℃过夜。在这2种温度下,缺T-凸出端的载体会自连,产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数 克隆 要求,为提高连接效率,需4℃过夜。
2)PCR产物是否需要用凝胶纯化?
如凝胶分析扩增产物只有一条带,不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带,可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高,这会产生高比例的带有引物二聚体的 克隆 ,而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。
3)如果没有回收到目的片段,还需要作什么对照实验?
A)涂布未转化的 感受态细胞 。
如有菌落,表明氨苄失效,或污染上带有氨苄抗型的质粒,或产生氨苄抗型的菌落。
B)转化完整质粒,计算菌落生长数,测定转化效率。
例如,将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul 感受态细胞 转化。用SOC稀释到1000ul后,用100ul铺板。培养过夜,产生1000个菌落。转化率为: 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。
铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA,用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA,用1/10铺板,共用1 ng DNA。转化率为:
1000克隆X10(3次方) ng /铺板1 ng DNA ug=10(6次方)cfu/ ug
转化pGEM-T应用10(8次方)cfu/ ug 感受态细胞
如没有菌落或少有菌落,感受态细胞的转化率太低。
C)如用pGEM-T正对照,或PCR产物,产生>20-40蓝斑(用指定步骤10(8次方)cfu/ ug感受态细胞),表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶(M1801,M1804,M1794)质量标准好无核酸酶污染,不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。
D)用pGEM-T或pGEM-T Easy载体,连接pGEM-T正对照,转化高频率感受态细胞(10(8次方)cfu/ug),按照指定的实验步骤,可得100个菌落,其中60%应为白斑,如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落,连接有问题。
4)对照实验结果好,却没有回收到目的片段,实验出了什么问题?
A)连接用室温保温1小时,能满足大多数克隆,为提GX率,需4℃过夜。
B)插入片段带有污染,使3`-T缺失,或YZ连接,YZ转化。为此,将插入片段和pGEM-T正对照混合,再连接。如降低了对照的菌落数,插入片段需纯化,或重新制备。如产生大量的蓝斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
C)插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段,因受UV过度照射,时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体,不利于连接,DNA必需重新纯化。
D)带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A,后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料(TM042)。
E)高度重复序列可能会不稳定,在扩增中产生缺失和重排,如发现插入片段高频率地产生缺失和重排,需用重组缺陷大肠杆菌菌株,如SURE细胞
转自生命科学论坛
仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。
相关热词:
金相分析仪,油品分析仪,针焰试验仪,液位传感器,土壤测试仪,高效液相色谱仪价格,霉菌试验箱,跌落试验台,离子色谱仪价格,噪声计,集菌仪,接地电阻测试仪型号,柱温箱,旋涡混合仪,电热套,场强仪万能材料试验机价格,洗瓶机,匀浆机,耐候试验箱,熔融指数仪,透射电子显微镜。
- 2007-04-30 10:17:37
- 标签:
- 收藏(0) 赞(0) 踩(0)
-
随时了解更多仪器资讯,求购、招标、中标信息实时更新,厂商招商信息随时看。大量、齐全、专业的仪器信息尽在仪器网(yiqi.com)。扫一扫关注仪器网官方微信,随时随地查看仪器用户采购、招标需求!
-
HACCP体系在乳制品生产中的实施现状及有效应用研究-ATP荧光检测仪技术文2007-05-11 13:54:58
HACCP体系在乳制品生产中的实施现状及有效应用研究-ATP荧光检测仪技术文章HACCP
-
调味品中苏丹红的风险评估及其风险管理措施研究-ATP荧光检测仪技术文章2007-06-01 13:10:42
调味品中苏丹红的风险评估及其风险管理措施研究-ATP荧光检测仪技术文章调味品中苏丹红的风
-
番茄酱生产企业HACCP体系建立研究及存在的问题浅析-ATP荧光检测仪技术文2007-06-03 11:13:28
番茄酱生产企业HACCP体系建立研究及存在的问题浅析-ATP荧光检测仪技术文章番茄酱生产
-
天津地区中小出口食品企业HACCP应用现状及对策探讨-ATP荧光检测仪技术文2007-06-11 12:22:21
天津地区中小出口食品企业HACCP应用现状及对策探讨-ATP荧光检测仪技术文章天津地区中
-
原装BURKERT角座阀2000系列技术文章2004-07-19 09:04:10
原装BURKERT角座阀2000系列技术文章欢迎光临东莞市科比特公司,今天给大家介绍的是BURKE
-
威格士VICKERS叶片泵专业技术文章2004-07-19 09:04:10
威格士VICKERS叶片泵专业技术文章VICKERS叶片泵均为卧式、单泵壳结构的离心泵。采用特殊的
-
德国赫斯曼交换机专业性技术文章2004-07-19 09:04:10
德国赫斯曼交换机专业性技术文章赫斯曼交换机的全双工是指赫斯曼交换机在发送数据的同时也能够接收数据,
-
德国GSR高压电磁阀实用技术文章2004-07-19 09:04:10
德国GSR高压电磁阀实用技术文章GSR高压电磁阀是用来控制流体的自动化基础元件,属于执行器;并不限
-
技术文章之GSR电磁阀维修技术2004-07-19 09:04:10
技术文章之GSR电磁阀维修技术德国GSR是防爆出名的,那么我们在使用GSR电磁阀的同时,也应该适当
-
关于热工宝典技术文章的 热工宝典2004-07-25 09:29:08
关于热工宝典技术文章的 关于热工宝典技术文章的 热工宝典 HR-2000热工宝典从事工业自动化控制行
PCR常见问题2-混匀仪技术文章
-
您可能感兴趣
![](https://static.yiqi.com/Pingce/img/imgddd.png)
①本文由仪器网入驻的作者或注册的会员撰写并发布,观点仅代表作者本人,不代表仪器网立场。若内容侵犯到您的合法权益,请及时告诉,我们立即通知作者,并马上删除。
②凡本网注明"来源:仪器网"的所有作品,版权均属于仪器网,转载时须经本网同意,并请注明仪器网(www.yiqi.com)。
③本网转载并注明来源的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品来源,并自负版权等法律责任。
④若本站内容侵犯到您的合法权益,请及时告诉,我们马上修改或删除。邮箱:hezou_yiqi