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- 【导读】牛血清白蛋白(BSA)在生化实验中有广泛的应用,例如在WB实验中加入BSA,通过提高溶液中蛋白质的浓度,对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附,能减轻有些酶的变性,减轻不利环境...
牛血清白蛋白(BSA)在生化实验中有广泛的应用,例如在WB实验中加入BSA,通过提高溶液中蛋白质的浓度,对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附,能减轻有些酶的变性,减轻不利环境因素如加热,表面张力及化学因素引起的变性的。具体的WB实验操作和BSA在实验中的应用爱必信分享如下:一.蛋白质的样品制备:取心肌组织50mg,待组织块自行溶解,用滤纸吸去其表面水分,将组织块放入玻璃匀浆器球状部位,用组织剪尽量将其剪碎,将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部,按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF(先加RIPA再加PMSF),将玻璃匀浆器插入冰中,匀浆约30分钟。将心肌组织匀浆转移到离心管中,4℃12000g离心5分钟,收集上清(如有粘稠物进一步用超声处理),样品分装冻存于-20℃备用。二.测定蛋白浓度:1.按50:1配置BCA工作液。2.210ulC液(蛋白标准)+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。2.3分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中,在其他样品孔中加入10ul待测样品。2.4分别加PBS定容至20ul。2.5各孔中加入200ulBCA工作液,室温放置2小时。2.6用酶标仪测定蛋白浓度:测定A562,依标准曲线算出蛋白浓度。三.SDS-PAGE电泳:
3.1制胶:按比例配制分离胶,缓缓地摇动溶液,使激活剂混合均匀,将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中,再在液面上小心注入一层水,以阻止氧气进入凝胶溶液中,静置40min。同前按比例配制浓缩胶,但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分,连续平稳的注入凝胶溶液,然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡,静制60min以上以保证完全聚合。3.2预电泳:将聚合好的凝胶安置于电泳槽中,小心拔去梳子,加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。(目的是清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通)。3.3样品准备:首先计算上样体积,然后按样品:上样buffer=4:1的比例加入上样bufer混匀,沸水煮10分钟,冰上5分钟。3.4加样:预电泳后依次加入标准品(Marker)和待分析样品。(加样时间要尽量短,以免样品扩散,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。3.5电泳:加样完毕,选择80V恒压进行电泳,电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处(一般约20分钟),更换至100V恒压电泳,电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处,即停止电泳(一般约为1小时20分钟)。四.转膜:4.1切胶:将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中,将目的蛋白所在区域切下来,测量其长宽,并记录。4.2剪膜和滤纸:按胶的尺寸剪膜和滤纸(滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm,PVDF膜长宽较凝胶大0.5~1mm),滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟,膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟,然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟,进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。4.3向电转槽中倒入部分电转液,将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”(注意避免两边滤纸相互接触,以免发生短路)。从正极到负极按如下顺序排列:正极-海绵-双层滤纸-PVDF膜-凝胶-双层滤纸-海绵-负极。(其中不能留有气泡)卡紧转膜板,电转槽中倒满电转液,将转膜板浸入电转槽中,注意正负极要正确。插上电源,设定恒流20mA转膜,4℃冰箱中过夜。五、膜的封闭:用TBST液洗涤印迹膜10分钟x2次。放入5%BSA(abs49001012)封闭液内,摇床震动,70转/分钟,室温封闭1小时30分钟。六、一抗孵育:6.1配制一抗:按相应抗体的效价加入一抗稀释液,一抗稀释液按0.05%TBST(ml):BSA(g)=20:1配制。6.2一抗孵育:将封闭后的膜放入杂交袋中,加入一抗约1ml,室温摇床(70转/分钟)孵育1小时30分钟。6.3用TBST洗涤膜10分钟x3次。七、二抗孵育:7.1配制二抗:按相应抗体的效价加入二抗稀释液,二抗稀释液按0.05%TBST(ml):BSA(g)=20:1配制。7.2二抗孵育:将一抗孵育后的膜放入二抗中,室温摇床(70转/分钟)孵育1小时30分钟。7.3用TBST洗涤膜10分钟x3次。八、ECL显色8.1配制ECL工作液:在避光的容器中按A液:B液=1:1的比例配制。8.2按膜:工作液=10cm2:1ml的比例将ECL工作液覆盖到膜表面,放置1~2分钟后在凝胶成像系统中观察、拍照。仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。
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- 2004-08-23 09:23:04
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