疯牛病夹心酶联免疫吸附测定方法

本方法（PLATELIAELISA）是一种快速、准确性高的疯牛病筛选方法之一，1999年通过欧盟认证。该方法具有反应时间短、成本低、反应步骤少的特点。疯牛病夹心ELISA是法国原子能委员会（FrenchAtomicEnergyCommission）研制出来的一种诊断疯牛病的快速方法，现被美国Bio-Rad公司收购。该方法又称PLATELIA~BSE试验，它由两种试剂盒组成，即BSE纯化试剂盒和BSE检测试剂盒。本方法的原理是用BSE纯化试剂盒中的试剂和蛋白酶K对牛脑脑干部的朊毒体进行消化、纯化、浓缩和溶解。BSE检测试剂盒是用两种单抗通过免疫酶技术对异常PrP进行检测的试剂盒，本试剂盒可检测180个样本。酶标板有12X8个孔，每孔包被有一抗（PrP单抗），同时另一单抗标记了过氧化物酶。反应结束后用酶标仪读数，测定样本的OD值判定结果。

本方法的耗时约为5h，特异性和敏感性均为100％。

疯牛病夹心ELISA检测方法的主要步骤如下。

（1）BSE病原纯化从脑闩部取（350±40）mg神经组织。将样品转移到研磨管，用专配的细胞破碎仪匀浆一个循环45s。当研磨不充分时，可以多做1-2个循环，但注意在每个循环之间要保持管子的温度在室温或4~C。取匀浆液500~L样品转移到2ml的离心管中。取500~L配好的PK酶溶液加到离心管中，混匀并在（37土1）℃下水浴或恒温箱内孵育。在离心管中加入500~L试剂B，混匀直至均一的蓝色。在室温下20000g离心5min或15000g离心7rain。弃去上清液，然后用吸水纸吸干每一管。在每管中加入50t~L试剂CI，（100土1）℃下孵育（5i1）min，然后在每管中加入250gL试剂R6。

（2）BSE病原检测以下面的顺序在各孔中加入相应溶液：A1、B1、C1、D1加入100ml+阴性对照液R3；E1、P1加入100~L阳性对照液R4；G1、H1等加入100uL已稀释的样品溶液。盖上密封膜在（37土1）℃下孵育（75土15）min。洗完板后在每孔中加入100~L酶标一抗，盖上密封膜并在2～8~C下孵育（60±5）min。洗完板后在每孔中加入100~L显色液并在室温下暗处孵育30min。与加显色液的顺利一致在每孔中依次加入100pL终止液。在终止反应后擦干酶标板的底部，在30min内用测量值为450nm，参考值为620nm处读数，得到各孔的OD值。

（3）结果分析当有一个阴性对照的OD值在正常范围之外或超出OD平均值的40％，则该值视为脱离正轨的值，要淘汰，然后重新计算其他三个阴性对照的OD平均值，将此值作为本实验的CUT-OFF值。如果有两个或更多的阴性对照OD值在正常范围之外或超出OD平均值的40％，则重做实验。阳性对照的OD值必须大于或等于1．0。

若样品的OD值小于CUT-OFF值则样品视为阴性。当然，如果样品的OD值刚刚低于CUT-OFF值（差值小于CUT-OFF值的10％），则该结果要慎重考虑，并且相应的样品需重新实验。若样品的OD值大于或等于CUT-OFF值，则初次判定为阳性，并需重新实验。重复实验后发现样品的OD值还是大于或等于CUT-OFF值，则判为阳性。若重新实验后样品的OD值低于CUT-OFF值则需用其他方法（如免疫组织化学或免疫印迹方法）进行确诊。若重新实验后实验结果还是刚刚低于CUT-OFF值，则也需用其他方法（如免疫组织化学或免疫印迹方法）进行确诊。

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