关于明胶酶谱法试剂盒脱色液配方的注意事项

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本公司销售的基质金属蛋白酶MMP2/MMP9明胶酶谱试剂盒，其中脱色液配方：冰醋酸:甲醇:水＝7:5:88（V:V:V），很多老师不明年这里面的冰醋酸是什么，我们今天给大家讲解一下。

这个冰醋酸不是醋酸也不是乙酸，冰醋酸也叫冰乙酸，就是纯的无水乙酸。不过我们选择常规的98%乙酸也是可以的。

检测步骤：

1.制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶：推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS-PAGE凝胶。将10×substrateG融化，并90C加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10×substrateG并使之稀释10倍，混匀后加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。

2.待测样品1:1稀释于2×SDS-PAGEnon-reducingbuffer(用完后可自行配制：4%SDS,100mMTris-ClpH6.8,20%glycerol,0.02%bromophnolblue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染Marker即可。阳性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔100l全血与100l2×SDS-PAGEnon-

reducingbuffer等体积混合，取5-15l上样。

3.低电流恒流电泳，每一块小胶电流为20mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

4.洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内.可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10ml

1×BufferA(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶2×30分钟。中间换液。

5.孵育：倒掉BufferA。加入10ml1×BufferB(蒸馏水稀释)，室温或37C孵育1~5小时。阳性对照或者血中的MMP通常37C孵育1小时即可显示。如MMP活性低，应延长孵育时间为10小时或过一夜。

6.显色：倒掉BufferB，加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有MMP条带的位置不被染色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72(MMP-2)、92(MMP-9)、130(proMMP-9)、225(proMMP-9)kDa位置出现透明条带。

7.条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑色.MMP条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中Z常见的格式。

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