农残检测ELISA试剂盒研究

本研究以农药三唑磷及克百威为研究对象，采用分子模拟方法对其半抗原分子进行了设计并合成得到了两种优化的三唑磷半抗原两种半抗原O-乙基，O-[1-苯基-（H-1,2,4-三唑-3-基），N-（3-羧基-丙基）]硫代磷酸胺（THBu）、O-乙基，O-[1-苯基-（H-1,2,4-三唑-3-基）,N-（5-羧基-丙基）]硫代磷酸胺（THHe）和一种克百威半抗原4[[（2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧）羰基]氨基]丁酸（BFNB）。上述半抗原分别与载体蛋白偶联制备成人工抗原，免疫小白鼠，再采用杂交瘤技术制备出了对应单克隆抗体。经测定，抗体（腹水）的效价均在10~6以上，与对应农药的结构类似物的交叉反应率均较低，表现出很高的特异性。在此基础上，通过对固相载体、包被缓冲液、有机溶剂、包被条件、洗涤次数、酶的种类、封闭物种类、点板时间、工作浓度、稳定剂以及不同ELISA模式等因素的筛选比较，优化了三唑磷和克百威ELISA方法和条件。优化后结果显示：Costar酶标板（美国）吸附效果和均一性较好；抗体以PBS（pH7.4，0.01M）作为包被介质较为理想，人工抗原则以CBS（pH9.5，0.05M）作为包被介质较为理想；包被条件以在37℃下包被2h效果为佳；反应介质加入2％牛奶可减少非特异性吸附，提高检测灵敏度；有机溶剂中甲醇对ELISA反应的影响较小，反应体系中Z终含量10％为佳；HRP酶作为显色反应的催化剂比AP酶更为理想；包被抗原直接竞争ELISA模式OD值的平行性不如包被抗体直接竞争ELISA模式的好；优化出的稳定剂可使包被在酶标板上的抗体在37±1℃条件下保存14天而抗体活性基本保持不变。利用优化后的分析条件，建立了农药三唑磷异源直接竞争ELISA方法（包被抗体模式）和克百威直接竞争ELISA方法（包被二抗模式）。在考察了不同样品基质对ELISA方法的影响后，进一步对蔬菜样品、水果样品、水、土等环境样品进行了三唑磷和克百威添加回收率试验，检测结果进行了统计分析，考察了方法的准确度与精密度，并对不同处理组间、相同处理组板间的检测数据进行了显著性检验，确定了不同样品的方法本底值、Zdi检测限及检测结果阴性／阳性判定方法，Z终构建了三唑磷ELISA快速测定试剂盒和克百威ELISA快速测定试剂盒。结果表明，三唑磷ELISA方法的检测灵敏度达到了2.66ng／mL（检测线性范围为1.95-2000ng／mL），克百威ELISA方法的检测灵敏度为0.97ng／mL（检测线性范围为0.8-340ng／mL），实际样品中的Zdi检测限达到或接近（部分超过）了一些国家和地区的残留限量（MRL）标准。通过本课题的研究，在国内外首次研制出了三唑磷半抗原、抗三唑磷单克隆抗体及其ELISA试剂盒；在国内首次研制出了抗克百威单克隆抗体及其ELISA试剂盒；在国内首次系统建立了农药等小分子化合物ELISA快速测定试剂盒国产化生产的技术体系。试制的试剂盒产品经农业部农药检定所、农业部环境质量监督检验测试ZX（天津）、等5家权威检测机构应用，证明该技术可靠，产品质量和性能稳定，可用于指导生产。（转自论文网）

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