献给初学者：如何用 Pubmed 设计 qPCR 引物

今天准备跟大家分享一下qPCR引物设计的具体流程。在进行引物设计之前，首先大家都应该了解引物设计需要注意的一些细节与原则，归纳如下：

引物设计原则

引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。

产物不能形成二级结构。

引物长度一般在15～30碱基之间。G＋C含量在40％～60％之间。

碱基要随机分布。

引物自身不能有连续4个碱基的互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物5′端可以修饰。引物3′端不可修饰。

引物3′端要避开密码子的第3位。

引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件Z佳。

Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4（G＋C）＋2（A＋T），在Oligo软件中使用的是Z邻近法（thenearestneiormethod）。尽可能使用两条引物的Tm值相同（Z好相差不要超过5℃），退火温度根据较低的Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度。而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从「Z近邻位」的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大多数都采用这种方式。

对于Tm值的计算有争议的地方是附加序列应不应该计算在内，我觉得有值得商讨的地方。因为从理论上只有Z开始的循环引物的附加序列是不与模板链结合的，而在后来的PCR反应中，引物的附加序列是和模板链结合了的。

ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3'端ΔG值较低（值不超过9），而5'端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3'端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal／mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

引物的3'端要与模板严格配对，而5'端碱基没有严格的限制，只要与模板DNA结合的部分足够长，其5'端碱基可不与模板DNA配对而呈游离状态，这样，我们可以在引物的5'末端加上酶切位点（引入酶切位点时，要考虑到进行双酶切的共用缓冲液，否则给下游工作带来困难）、启动子，方便下游操作。

引物设计流程

了解了设计原则，接下来我们就看看具体的设计流程，本次讲解应用pubmed来设计。比如我们要设计小鼠源性白介素4（IL－4）的引物。

首先打开pubmed，输入如图，点击搜索：

在搜索结果中选择一个点击进入，得到如下信息：

点击上述界面右侧的PickPrimers。

点击之后进入如下界面，根据上述引物设计原则里面所述原则，填写好相关的产物长度，引物长度，Tm值、FASTAsequence等信息之后，点击getprimers。

点击之后就能得到很多条引物序列啦，根据需要及引物设计原则选择合适的引物序列即可。

引物设计好后，再应用BLAST检验一下。步骤如下，打开pubmed，点击首页下方BLAST。

将刚刚选择的引物序列输入，如图：

点击blast，得到：

搜索结果中有我们刚刚查询的NM-021283.2，说明此序列无误。

另外，我们还可以应用OligoCalc来检测引物互补情况，点击网址http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html。进入界面输入刚刚选择的引物序列。

点击Check即可，结果显示none，则为无互补情况，引物可行。

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