染料法猫血支原体实时定量PCR试剂盒

染料法猫血支原体实时定量PCR试剂盒

Dye-quantitative Real-time PCR Kit for Mycoplasma haemofelis

货号：Mqs-hfe-20    20个反应

货号：Mqs-hfe-50    50个反应

货号：Mqs-hfe-100    100个反应

储存：-20度，避光保存，有效期一年。避免反复冻融。

试剂盒特点：

1， 特异性识别猫血支原体和犬血支原体，不受猫和犬的其他寄生微生物的干扰。

2， 使用热启动的Taq酶，可抑inhibit制非特异性扩增，降低背景荧光。

3， 带有阳性对照样品（组分C），可用于检验试剂盒有效性，以及验证待测样品中是否含有PCR抑inhibit制剂。

4， 带有ROX参比染料，帮助校正加样误差和管间差异。

5， 带有UDG酶和dUTP，可降低残留DNA的污染。

猫血支原体（Mycoplasma haemofelis），或称为猫嗜血支原体、猫附红细胞体，寄生于猫红细胞表面，具多形性，可呈现为球状、环状或杆状，对红细胞有破坏作用，可引起传染性溶血贫血症，有时呈急性发作，可致命；有时呈慢性发作，出现嗜睡、厌食、粘膜惨白及黄疸、发烧、脾spleen脏肿大等症状，并可能出现反复发作。其传播途径为血液传播，包括：吸血昆虫叮咬、咬伤、输血等。

目前已知寄生于猫血中的支原体有三种：猫血支原体，Candidatus Mycoplasma haemominutum和Candidatus Mycoplasma turicensis；在PCR技术出现之前，这三种支原体被统称为猫血巴尔通氏体（Haemobartonella felis）。有报道约14%的贫血猫呈血液支原体阳性。猫血支原体的致病能力强于猫血中的另两种支原体。

寄生于犬血中的支原体有两种：犬血支原体（Mycoplasma haemocanis)和Candidatus Mycoplasma haematoparvum。犬血支原体与猫血支原体亲缘关系非常近，形态也类似。在实验条件下，猫可以感染犬血支原体，而犬不能感染猫血支原体。犬血支原体感染后有时不表现出症状，有时可能引起一些症状，包括：脱水、轻度贫血、心跳过速、黄疸、死亡，但是很少引起明显的溶血，除非是做了脾切除手术或者发生了免疫抑inhibit制。犬血支原体是犬类中最常见的嗜血支原体，分布极为广泛，阳性率大约在0.5-40%之间。常用的检测方法包括显微镜镜检法和PCR法。镜检法灵敏度低，实验误差大，无法区分支原体种类，易受血液中其他物质以及人工涂片方法的干扰，且支原体易从红细胞表面脱落，造成漏检。而PCR法在灵敏度上则有明显的优势，且可以区分支原体种类。定量PCR法与普通PCR法相比，不仅可以精确定量，而且操作更为方便，更少受环境污染的影响。

本试剂盒针对猫血支原体的16S rRNA基因的保守区域，设计特异性引物，可准确识别猫血支原体和犬血支原体,仅与Mycoplasma haemobos有交叉反应。Mycoplasma haemobos寄生于牛血中，不会对本试剂盒的检测产生影响。对320只猫的检测表明，嗜血支原体的总阳性率为43.4%，猫血支原体的阳性率为12.8%。

本试剂盒包含热启动Taq酶、dNTP（以UTP代替了TTP）、引物、阳性对照品、SYBR Green I染料、ROX染料，和用以防止残余DNA污染的UDG（尿嘧啶-N-糖苷酶），用户只需准备好DNA样品即可使用。

热启动Taq酶结合了特异性单克隆抗体的DNA聚合酶，在室温下聚合酶活性被抗体抑inhibit制。在PCR循环的变性阶段，抗体受热被去除，聚合酶活性恢复，因此获得“热启动”功能，可减少残余DNA的污染，提高PCR扩增效率、灵敏度和目的片段产量。

SYBR Green I可以与DNA双链的小沟结合，结合后在497nm激发光照射下产生520nm的发射光。未结合双链DNA的SYBR Green I基本不产生荧光。因此可以根据荧光值的大小判断溶液内DNA双链的多寡，用于实时检测PCR反应过程中产物的累积量。初始模板浓度越高，反应循环数越高，则双链DNA含量越高，荧光值也就越高。值得注意的是，SYBR Green I也可以结合非特异性PCR产物以及引物二聚体，此时产生的荧光与目标扩增产物无法区分。为了判断荧光信号是否来自目标扩增产物，可以绘制熔解曲线。通过逐步缓慢升温，使双链DNA解离为单链DNA，同时检测荧光值的变化，绘制曲线，根据荧光值观察DNA解链的温度。本试剂盒目标扩增产物的Tm值在81-86度范围内。

UDG和dUTP可以阻止前次步骤残余DNA的扩增。dUTP可以确保扩增后的DNA中均含有尿嘧啶。UDG可从单链或双链DNA上去除尿嘧啶残基，从而阻止含有尿嘧啶的DNA作为下几轮PCR的模板。在PCR循环开始前的UDG孵育步骤，可以破坏带有尿嘧啶的PCR产物。经过该去除污染步骤后，UDG在正常的PCR循环过程中被高温灭活，对PCR反应没有影响。

ROX不参与PCR反应，在PCR反应过程中荧光没有变化，可以提供一条基线用于校正加样误差和管间差异，便于仪器自动分析报告荧光与内参ROX荧光的比值，使定量更准确。ROX染料的激发波长为584nm，发射波长为612nm。用ROX进行校正后可以使实验误差减小十倍左右。

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