茎尖脱毒的实例

（一）、茎尖脱毒
1、茎尖脱毒的依据。
病毒在植物体内分布是不均一的，越接近生长点约（0.1-1mm区域），病毒浓度越稀，因此有可能采用小的茎尖离体培养而脱除植物病毒。
2、茎尖培养法脱除植物病毒的技术关键
（1）、被脱毒植物携带病毒的诊断及其在体内的分布
再脱毒之前，应了解植物携带何种病毒，病毒在体内的分布位置，以确定培养茎尖的大小
（2）、母体植株的选择和预处理
母体的选择：
欲脱毒材料的品种典型性：关系到脱毒以后的脱毒苗是否保持原品种的特征特性
植体健康程度选择：应选感病轻、带毒量少的健康植株作为脱毒的外植体材料，这样更容易获得脱毒株。
外植体预处理：
（3）、茎尖的剥离
在剥取茎尖时，把茎芽置于解剖镜下（8~40倍），一只手用镊子将其按住，另一只手用解剖针将叶片和叶原基剥掉，解剖针要常常蘸入90%酒精，并用火焰灼烧以进行消毒。但要注意解剖针的冷却，可蘸入无菌水进行冷却。当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下来，为了提高成活率，可带1-2枚幼叶，然后将其接到培养基上。接种时确保微茎尖不与其他物体接触，只用解剖针接种即可。剥离茎尖时，应尽快接种，茎尖暴露的时间应当越短越好，以防茎尖变干。可在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，有助于防止茎尖变干。
将接种好的茎尖置于25℃左右的温度下。每天以16小时 2000-3000lx的光照条件下培养。由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月才能成功。
继代培养得到足够的检测苗、进行病毒检测。
（4）、脱毒效果检测
A 指示植物鉴定(indicator test plants) 所谓指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的寄主植物。
每种病毒都有自己敏感的植物，例如：
马铃薯病毒的敏感植物有千日红、黄花烟、心叶烟、毛叶曼佗罗
大丽花病毒的敏感植物为：矮牵牛、黄瓜、苋色蓠
菊花病毒：矮牵牛、豇豆
指示植物鉴定病毒的方法
a.摩擦接种法：
取培养植株的叶片置于研钵中，加入少量的水和等量的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0），磨成匀奖，将其涂抹在指示植株叶片上，在指示植物的叶片撒上金刚砂，通过轻轻摩擦使汁浸入叶片表皮细胞而又不损伤叶片。5分钟后用清水清洗叶面。将指示植株放于防蚜虫网罩的温室内。然后视其病斑的有无，来判断是否脱除了病毒。
例如：植物液接种后如使千日红叶片枯斑，黄花烟、心叶烟呈花叶，证明该植物体内具有马铃薯X病毒
b、嫁接法
有些病毒不是通过汁液传播，而是通过专门的介体传播的，例如草莓黄花病毒、草莓丛枝病毒是通过一种特殊的蚜虫为介体进行传播的。这种病毒的鉴定，需将培养植株的芽嫁接在敏感植物上，根据敏感植株的病症来判断是否脱除了病毒
B 血清鉴定(serologic test) 试管沉淀反应；免疫双扩散；酶联免疫吸附测定(ELISA)。
a、试管沉淀反应
在抗原-抗体Z适比例的条件下，观察有无沉淀的产生来确定被测植株是否带病毒。试管沉淀反应操作简单，需注意的问题：
①、叶绿体的自发凝聚
可用磷酸缓冲液提取汁液，再用氯仿处理除去叶绿体，pH 保持在6.5-8.5）
② 、抗原抗体的比例要适当，当抗原过量时回YZ沉淀的形成
b、免疫双扩散
在半固体凝胶中测定在其中扩散的抗原和抗体间的沉淀反应的方法。与沉淀法比较起来有两个优点：一是节约血清，二是汁液不用特殊处理。
步骤：
①倒胶，一般厚2mm
②打孔，多打成梅花型
③加样，加血清和汁液。
一般加样后在37℃恒温过夜，即可进行结果观察。有扩散沉淀的即为带毒株，没有则为不带毒株
c、酶连免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）
它是将抗原、抗体的免役反应和酶的GX催化反应有机结合起来的一种综合性技术。即通过化学的方法将酶与抗体或抗原结合起来，形成酶标记物。然后将它与相应的抗原或抗体起反应，形成酶标记的免疫复合物。结合在免疫复合物的酶，在遇到相应的底物时，催化无色底物生成有色底物，通过比色计可以准确测定。优点是灵敏度高，测定快速，每次可以同时测定多个样品。

C 电镜检查法
采用电子显微镜，可直接观察样品材料有无病毒存在，还可以进一步鉴定病毒颗粒大小、形状和结构，这些特征相当稳定，因此电镜检查法即准确又有效，但需要有一定的设备和技术。
D 分子检测法
例如RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reation）将待测的样品的总RNA与cDNA合成的试剂盒进行反应，合成cDNA，然后利用病毒DNA特有的序列设计引物进行PCR反应，即可知道在寄主中是否有病毒基因的表达
n 脱毒苗的离体保存与繁殖:一般是在实验室进行，一般每月继代一次，可以在培养基中加入生长延缓剂，如B9和矮壮剂可2-3个月继代一次，也可放到液氮或4℃冰箱中保存
n 建立脱毒种苗生产繁殖网络体系：如果试管苗生产成本过高或移栽困难，可将试管苗选择种植在一定的控制区域，从繁殖技术和环境隔离上保证较高水平，使得繁殖的种苗能有效的防止病毒的再侵染
（5） 影响脱毒效果的因素
n 母体材料病毒侵染的程度:单一病毒感染的植株脱毒较容易，而复合浸染的植株脱毒较难
n 外植体的生理状态:顶芽的脱毒效果比侧芽好，生长旺盛的芽比休眠芽或快进入休眠的芽好
n 起始培养的茎尖大小:不带叶原基的生长点培养脱毒效果Z好，带1-2个可获得40%脱毒苗
实例：

1.马铃薯是用块茎种植的无性繁殖作物，在生长期间容易被病毒侵染造成
病毒性退化，并常受晚疫病、环腐病、青枯病和黑胫病等多种病害侵袭。所
以马铃薯虽然是高产作物，但常常并不高产、稳产。特别是病毒性退化，是
各地马铃薯生产的主要威胁。为了解决这一问题，我国于70 年代引进了马铃
薯茎尖脱毒技术，80 年代逐渐普及到各省、市、自治区。现在许多研究单位
均已掌握了马铃薯脱毒苗的生产与快繁技术，脱毒薯正在迅速推广，并比一
般种薯增产30％～50％，甚至一倍以上，很受农民欢迎。同时我国各地在马
铃薯生产过程中，因地制宜地创造了多种保种技术，如一季作地区的夏播留
种；中原二季作地区的阳畦留种和春季早收留种并实行秋播；云南一些地区
的三季薯留种法等。这对防止马铃薯种薯的迅速退化和减产都有显著作用。
脱毒薯和留种技术相结合，既能增产，又能延长种薯使用年限。
2.南罗平小黄姜的茎尖脱毒组培快繁