用Ni亲和层析柱纯化His标签融合蛋白时需要注意哪些事项

使用Ni柱纯化带有His标签的融合蛋白，是我们大家再熟悉不过的实验操作了.我们对整个操作的流程及注意事项，很可能是师从兄师姐那里获得的.这 些经验都是大家智慧的结晶.同时，这也有一定的不足之处，那就是我们学习到的是局部，还有一些我们不常用或者基本不会接触到的面儿，那些知识我们应该从哪 里掌握呢?
给大家推荐一个办法，那就是参考那些大公司的实验手册.一般像GE、Qiagen等知名公司，都有Ni柱柱材料的产品，因此关于柱材料的各种性质参数，以及使用方法和注意事项都有详细的说明.
下面我就列举一些我从这些实验手册里总结出来的一部分Tips，仅供参考.
1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等；
2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等；
3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，比如DTT，防止二价Ni被还原；
4. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；
5. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶YZ剂，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；
6. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度Z高可达50%（v/v）
7. 应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；
8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；
9. 可加入变性剂促溶，盐酸胍（Z高可6M），尿素（Z高可8M）
10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，Z高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染