diyi法大肠杆菌MPN 计数
操作步骤
6.1、 样品的稀释
6.1.1、 固体和半固体样品：以无菌操作取259 样品，置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8000r / min ～1000r/ min 均质1 min～2 min ，制成l:10 样品匀液，或置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min 制成1:10 的样品匀液。
6.1.2、 液体样品：以无菌吸管吸取样品25 mL 置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10 的样品匀液。
6.1.3、 样品匀液的pH 值应在6.5～7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH）或1mol/L 盐酸（HCI）调节。
6.1.4、 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL ，沿管壁徐徐注人盛有9 mL 磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其棍合均匀，制成1:100 的样品匀液。
6.1.5、 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。
6.2、 初发酵试验
每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液）。每个稀释度接种3 管月桂基磺酸盐胰蛋白陈（LST ）肉汤，每管接种1 mL（如接种量超过1 mL ，则用双料LST 肉汤）。36℃±1℃ 培养24h±2h ，观察小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h～48h 内产气的LST 肉汤管数。如所有LST 肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN 结果；如有产气者，则进行复发酵试验。
6.3、 复发酵试验
用接种环分别从所有培养48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中取培养物1 环，移种于已提前预温至45 ℃ 的EC 肉汤管中，放人带盖的44.5℃ ±2 ℃ 水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h±2h ，检查小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h ±2h 。记录在24h 和48h 内产气的EC 肉汤管数。如所有EC 肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN 结果；如有产气者，则进行EMB 平板分离培养。
6.4、 伊红美蓝平板分离培养
轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物划线分别接种于EMB 平板，36 ℃ ±1 ℃ 培养18h～24h 。检验平板上有无具黑色ZX有光泽或无光泽的典型菌落。
6.5、 营养琼脂斜面或平板培养
从每个平板上挑5 个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落ZX部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，36 ℃ ±1 ℃ ，培养18h～24h 。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。
6.6 、生化试验
6.6.1、 靛基质试验：将培养物接种蛋白陈水，36 ℃±1℃ 培养24h±2h 后，加Kovacs 靛基质试剂0.2 mL～0.3 mL ，上层出现红色为靛基质阳性反应。
6.6.2 、MR -VP 试验：将培养物接种MR -VP 培养基，36 ℃ ±1 ℃ 培养48h±2h 。移取培养物1mL至13 mm×100mm 试管中，加5 % α-蔡酚乙醇溶液0.6mL、40 ％氢氧化钾溶液0.2mL 和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h ，如出现伊红色，为VP 试验阳性。
将MR 一VP 培养液的剩余部分再培养48h 后滴加5 滴甲基红指示剂。培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。
6.6.3、 柠檬酸盐利用试验：将培养物接种Koser 氏柠檬酸盐肉汤，36℃±1 ℃ 培养96h±2h，记录有无细菌生长。
6.7、 大肠杆菌MPN 计数的报告
大肠杆菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC 生化试验为＋＋- -或-＋- -。只要有1 个菌落鉴定为大肠杆菌，其所代表的LST 肉汤管即为大肠杆菌阳性。依据LST 肉汤阳性管数查MPN 表，报告每克（或毫升）样品中大肠杆菌MPN 值。
第二法大肠杆菌VRB - - MUG 平板计数法
8、样品稀释
按6.1 进行。
9、 检验
选取2 个～3 个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度分别取1 mL 注人两个无菌平皿。另取1 mL 稀释液注人一个无菌平皿中，作空白对照。将45 ℃±0.5 ℃ 的VRB 琼脂10 mL～15 mL 倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3 mL～4mL VRB-MUG 琼脂覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36 ℃±1 ℃ 培养18h～24h 。选择菌落数为10～ 100 的平板，暗室中360 nm～366 nm 波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。
检验时用已知MUG 阳性菌株（如大肠杆菌ATCC 25922 ）和产气肠杆菌（如ATCC 13048 ）做阳性和阴性对照。
10、 大肠杆菌平板计数的报告
两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每克（或毫升）样品中大肠杆菌数，以CFU/g ( CFU /mL ）表示。
第三法大肠杆菌PetrifilmTM 测试片计数法
12、 样品稀释按6.1 进行。
13、 检验
13.1、 接种和培养
选取2 个～3 个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种两张测试片。将测试片置于平坦实验台面，。揭开上层膜，用吸管吸取样品匀液1ml匀液垂直滴加在测试片的ZY，将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生和上层膜直接落下，将压板（平面底朝下）放置在上层膜ZY处，轻轻地压下，使样品匀液均匀覆盖于圆形的培养膜表面，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1 min 以使培养基凝固。将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不超过20 片，36℃±1 ℃ 培养。肉、家禽和水产品，培养时间为24h±2h；其他食品，培养时间为48h±2h 。
13.2、 判读
可肉眼观察计数，或用菌落计数器、放大镜、PetrifilmTM 自动判读仪计数。蓝色有气泡的菌落确认为大肠杆菌，不论蓝色的深浅，部分蓝色的带气泡菌落也判定为大肠杆菌。圆形培养膜边缘及边缘以外的菌落不计数。当测试片出现大量气泡、不明显的小菌落，培养区呈蓝色时，需要进一步稀释样品匀液，重新检验。 14 大肠杆菌测试片计数的报告
选择菌落数在15～150 之间的稀释度，两张测试片菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠杆菌数，以CFU/g ( CFU/mL ）表示。
如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15 ，计数Z低稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，以“小于1 乘以Z低稀释倍数”报告；如果所有稀释度的菌落数都大于150 ，计数Z高稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告。计数菌落数大于150 个的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以20 ，即为测试片上估算的菌落数（圆形生长面积为20 cm " ）。
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