一明妈妈
发布日期:2013-09-14
1. 称取2~5g 新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料,用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面,用滤纸吸干水分备用。叶片称重后剪成1cm 长,置研钵中,经液氮冷冻后研磨成粉末。待液氮蒸发完后,加入15mL 预热(60~65℃)的CTAB 提取缓冲液,转入一磨口锥形瓶中,置于65℃水浴保温,0.5~1h,不时地轻轻摇动混匀。
2.加等体积的氯仿/异戊醇(24:1),盖上瓶塞,温和摇动,使成乳状液。
3.将锥形瓶中的液体倒入离心管中,在室温下4 000r/min 离心5min,静置,离心管中出现3 层,小心地吸取含有核酸的上层清液于量筒中,弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。
4.根据需要,上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。
5.收集上层清液,并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入1~2 倍体积预冷的95%乙醇,边加边用细玻棒沿同一方向搅动,可看到纤维状的沉淀(主要为DNA)迅速缠绕在玻棒上。小心取下这些纤维状沉淀,加1~2 mL 70%乙醇冲洗沉淀,轻摇几分钟,除去乙醇,即为DNA 粗制品。
6.上述DNA 粗制品含有一定量的RNA 和其它杂质。若要制取较纯的DNA,可将粗制品溶于TE 缓冲液中,加入10mg/mL 的RNase 溶液,使其终浓度达50μg/mL,混合物于37℃水浴中保温30min 除去RNA。重复步骤2~5 的操作,可制得较纯的DNA 制品。
7.将DNA 制品溶于250μL 的TE 缓冲液中,完全溶解DNA 样品。
8.加入1/10 倍体积的3mol/L NaAc(pH6.8)和2 倍体积的95%乙醇,沉淀DNA,重复步骤5。Z后,将DNA 溶于250μL 的TE 缓冲液中。
9.在751 型分光光度计上测定该溶液在260nm 紫外光波长下的光密度值。代入下式计算DNA 的含量。
结果计算
式中OD260nm 为260nm 处的光密度;L 为比色杯光径(cm);0.020 为1μg/mL DNA 钠盐的光密度。
DNA 的紫外吸收高峰为260nm,吸收低峰为230nm,而蛋白质的紫外吸收高峰为280nm。上述DNA 溶液适当稀释后,在751 分光光度计上测定其OD260nm、OD230nm 和OD280nm。如OD260nm/ OD230nm≥2OD260nm/ OD280nm≥1.8,表示RNA 已经除净,蛋白含量不超过0.3%。
附 注
如果植物样品不经液氮处理,提取液中的CTAB 浓度需要提高到4%(W/V)。在许多情况下,使用0.1%(V/V)巯基乙醇,并不能完全YZ叶片中的氧化作用,但是,这种氧化作用不会影响限制性内切酶的活性。如果使用的巯基乙醇浓度高于0.1%(V/V),则会大大降低DNA 的得率。
1.制备的DNA 在:(1)含有螯和剂如EDTA 中较稳定,因为EDTA 能螯和Mg2+或Mn2+离子,YZDNase;(2)在pH5~9 之间较稳定,否则过酸过碱会破坏DNA 的结构;
(3)有一定离子强度(强度越高, DNA 越稳定)的溶液中较稳定。
(TE 满足以上要求, 但如需对所得DNA 进行酶切, EDTA 浓度不可过高, 一般用0.1×TE 或0.2×TE)。
2.为了保证植物DNA 的完整性:(1)整个提取过程应在较低温度下进行(一般利用液氮或冰浴);这样可防止和YZ内源DNase 对DNA 的降解;(2)当DNA 处于溶解状态时,要尽量减弱溶液的涡旋,动作要轻柔;在进行DNA 溶液转移时用大口(或剪口)吸管,尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏